Gibrid va gibridoma - Биотехнология - Презентации

Информация о документе

Цена	3000UZS
Размер	938.4KB
Покупки	0
Дата загрузки	27 Август 2024
Расширение	pptx
Раздел	Презентации
Предмет	Биотехнология

Gibrid va gibridoma

Купить

GIBRID VA GIBRIDOMA ПЛАН : 1. Гибридомная технология ( Rus tilida ) 2. Gibridoma texnologiyasi - Hybridoma technology 3.ГИБРИДОМА- балшая медицискя енсиклапедя

■ Современная наука достигла такого этапа развития, когда для исследования необходимы реактивы, способные взаимодействовать с индивидуальными молекулами либо с различными участками макромолекул, что обеспечивает точность качественного и количественного анализа. ■ Этим критериям идеально соответствуют молекулы иммуноглобулинов. Так как данные реагенты необходимы в большом количестве, перед исследователями была поставлена задача наладить производство антител одной специфичности (моноклональных) в промышленном масштабе. ■ Было предпринято множество попыток, из которых следует отметить методики получения моноклональных антител из опухолей лимфоидных тканей и производства поликлональных антисывороток. Предложенные методы имели целый ряд недостатков и не удовлетворяли предъявляемым требованиям

■ Лимфоидные гибридомы — это бессмертные клеточные клоны, продуцирующие антитела одной специфичности (моноклональные). Гибридомы получают посредством слияния раковой клетки лимфоидного ряда и «нормального» зрелого лимфоцита. От раковой клетки гибридома наследует способность к неограниченной пролиферации, а от «нормального» лимфоцита — способность синтезировать антитела. Гибридомы синтезируют на основе банка клеток- носителей (линий раковых клеток), клон лимфоцитов, в принципе, можно получить практически на любой интересующий антиген. На данный момент в мире существует более 50 тыс. гибридом. Получены гибридомы на основе клеток мышей, крыс, золотистого и китайского хомячков, клеток человека и т.д. Первоначально были получены гибридомы на основе клеток мыши линии balb/c, технология получен

■ Технология лимфоидных гибридом была разработана в 1975 году Мильштейном и Келлером, и уже к 1977 году ими было получено 16 типов гибридом, синтезирующих различные типы моноклональных антител. Первоначально гибридомная технология строилась на основе следующих разработок: имелись линии миеломных клеток мышей balb/c (дефектные по некоторым ферментам метаболизма нуклеиновых кислот, что являлось необходимым условием для селекции получаемых гибридом), полученные в результате развития методов получения миелом, посредством введения инертного пластика и минеральных масел в виде подкожных инъекций мышам; разработаны методы слияния клеток с помощью вирусов (вирус Сендай) и полиэтиленгликоля; разработаны методики избирательной селекции клеток с помошью среды ГАТ. Главной заслугой Мильштейна и Келлер

■ Гибридомная технология, в ее классическом варианте, выполняется в несколько этапов. В качестве предпосылок, необходимо иметь линию раковых клеток-носителей, дефектных по одному из ферментов (тимидинкиназе (ТК) или гипоксантингуанинфосфорибозилтрансферазе (ГГФРТ)), что само по себе определяет выбор способа селекции образующихся гибридом; разработанную процедуру слияния клеток; антиген, антитела на который необходимо получить исследователю, методики определения продуцируемых гибридомой антител с целью клонирования необходимой линии. При наличии всего вышеперечисленного процедура получения лимфоидных гибридом выглядит следующим образом (рис 1): ■ иммунизация животных выбранным антигеном и выделение «нормальных» лимфоцитов иммунизируемого животного после определения максимального титра интер

■ Клетки, имеющие дефект по одному из перечисленных ферментов (ТК или ГГФРТ), не способны расти в ГАТ среде, содержащей гипоксантин, тимидин и аминоптерин. Аминоптерин блокирует синтез dTMP посредством ингибирования дигидрофолят-редуктазы. Следовательно, в среде, содержащей аминоптерин, синтез пиримидинов может происходить только из готовых предшественников (из тимидина в данном случае). Клетки, содержащие дефектную ТК не способны расти в ГАТ среде. Клетки, содержащие дефектную ГГФРТ, способны синтезировать пурины из предшественников, но не из готовых продуктов (из гипоксантина в данном случае), следовательно, в ГАТ-среде данные клетки погибнут. В том случае, если произойдет слияние клеток таким образом, что у полученных гибридов дефектные ГГФРТ и ТК будут дополнены функциональными фермент

■ Такова классическая схема получения лимфоидных гибридом, предложенная Келлером и Мильштейном. До настоящего момента основная схема существенным образом не изменилась. С учетом всех вышеперечисленных предпосылок данная методика принята во множестве лабораторий мира и вполне оправдывает себя. Изменения касаются некоторых пунктов и в основном являются результатом модификации существующей процедуры под нужды конкретной лаборатории. Следует отметить следующие изменения: ■ Использование в качестве клеток-носителей других линий клеток, не имеющих дефект по вышеперечисленным ферментам, приводит к необходимости изменения процедуры селекции образующихся гибридом, т. к ГАТ-среда в данном случае не работает. Таким образом, разрабатываются методы селекции, подходящие для выбранных клеток. Примером та

■ Одной из основных трудностей, возникающих при получении лимфоидных гибридом, является наличие феномена элиминации хромосом, заключающегося в потере определенных хромосом в процессе культивирования. Данный процесс может служить причиной потери клеткой признаков, необходимых исследователю, в частности, потери способности к неограниченной пролиферации у раковых клеток и способности к синтезу иммуноглобулинов у гибридом. В данном процессе имеется корреляция между количеством хромосом и степенью их элиминации. Чем больше хромосом в клетке, тем меньше вероятность потери необходимых исследователю свойств. Следует заметить, что элиминация хромосом — процесс «направленный». Элиминации подвержены в большей мере те хромосомы, наличие которых не является необходимым клетке для выживания в данных усл

■ Гибридомная технология позволяет получать практически неограниченное количество моноклональных антител практически на любой существующий антиген. Эта методика по своим масштабам не имеет конкуренции и является лидером по коммерческому обороту. Так как каждая гибридома может продуцировать только один вид антител, является целесообразным разработка новых типов гибридом, основанных на клетках других организмов, что позволит не только получать моноклональные антитела, идеально подходящие для работы с данными видами, но и изучить особенности функционирования клеток последних, рассмотреть вопросы, касающиеся биосинтеза антител et cetera. В связи с этим, перспективным является получение лимфоидных гибридом на основе клеток кур. Клетки кур имеют ряд преимуществ по сравнению с клетками других в

■ Получение суспензии клеток костного мозга суточных цыплят; ■ Выделение из суспензии лимфоидных клеток посредством центрифугирования в градиенте плотности фиколла; ■ Культивирование лимфоидных клеток в полужидких агаровых средах; ■ Трансформация лимфоидных клеток с помощью химических канцерогенов; ■ Клонирование трансформированных лимфоидных клеток; ■ Иммунизация кур выбранным антигеном; ■ Определение титра антител и выделение лимфоцитов при его максимальном значении; ■ Проведение электрослияния трансформированных лимфоидных клеток с «нормальными» лимфоцитами; ■ Клонирование полученных гибридом. ■ Проведение индивидуального электрослияния клеток позволяет избежать процедуры селекции образующихся гибридом, т.к. в данном случае отбор будет производиться непосредственно во время слия

■ Monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish uchun ishlatiladigan gibridoma usulining umumiy vakili. ■ Gibridoma texnologiyasi bir xil sonli sonlarni ishlab chiqarish usuli antikorlar (shuningdek, deyiladi monoklonal antikorlar ). Ushbu jarayon sichqonchani (yoki boshqa sutemizuvchini) an bilan ukol qilishdan boshlanadi antigen bu immunitetga javob beradi. Oq qon hujayralarining bir turi B xujayrasi , AOK qilingan antigen bilan bog'lanadigan antikorlarni ishlab chiqaradi. B-hujayralarni ishlab chiqaradigan ushbu antikorlar sichqonchadan olinadi va o'z navbatida birlashtirilgan o'lmas B hujayrasi saraton hujayralari bilan, a miyeloma , [ tushuntirish kerak ] gibrid ishlab chiqarish hujayra chizig'i deb nomlangan gibridoma , bu B hujayrasining antikor ishlab chi

■ To'qimalar madaniyatida o'sadigan gibridoma hujayralari. Rasmda bitta hujayralar klonlari ko'rsatilgan bo'lib, ularning har biri ko'p miqdordagi o'ziga xos monoklonal antikor ishlab chiqaradi, ular hujayralar ajratadi va ularni madaniy muhitdan osongina tozalash mumkin. ■ Laboratoriya hayvonlari ( sutemizuvchilar , masalan. sichqonlar) birinchi navbatda antitel yaratilishi kerak bo'lgan antigenga ta'sir qiladi. Odatda bu bir necha hafta davomida ko'rib chiqilayotgan antijenni bir qator in'ektsiyalari bilan amalga oshiriladi. Ushbu in'ektsiyalardan keyin odatda in vivo jonli ravishda foydalaniladi elektroporatsiya , bu immunitet reaktsiyasini sezilarli darajada yaxshilaydi. Bir marta splenotsitlar sutemizuvchilardan ajratilgan taloq , B huja

1) Sichqonni emlash (2) B hujayralarini taloqdan ajratib olish (3) Miyeloma hujayralarini etishtirish (4) Miyeloma va B hujayralarining birlashishi (5) Hujayra chiziqlarini ajratish (6) Tegishli katakchalarni skrining qilish (7) in vitro (a) yoki jonli ravishda (b) ko'paytirish (8) O'rim-yig'im

■ Birlashtirilgan hujayralar HAT muhitida inkubatsiya qilinadi ( gipoksantin - aminopterin - timidin o'rtacha) taxminan 10 dan 14 kungacha. Aminopterin nukleotid sintezini ta'minlaydigan yo'lni to'sadi. Demak, eritilmagan miyeloma hujayralari nobud bo'ladi, chunki ular tomonidan nukleotidlar hosil qila olmaydi de novo yoki qutqarish yo'llari chunki ularga HGPRT etishmayapti. Eritilmagan miyeloma hujayralarini olib tashlash kerak, chunki ular boshqa hujayralardan, ayniqsa kuchsiz shakllangan gibridomalardan kattalashish imkoniyatiga ega. Birlashtirilmagan B hujayralari o'ladi, chunki ular qisqa umr ko'rishadi. Shu tarzda, faqat B hujayra-miyeloma duragaylari omon qoladi, chunki B hujayralaridan chiqqan HGPRT geni funktsionaldir. Ushbu hujayralar anti

■ Keyingi bosqich - tezkor birlamchi skrining jarayoni bo'lib, u faqat o'ziga xos o'ziga xos antitellarni ishlab chiqaradigan gibridomalarni aniqlaydi va tanlaydi. Amaldagi birinchi skrining texnikasi deyiladi Elishay . Keyin gibridoma kulturasi o'ta yuqori darajali, ikkilamchi fermentli konjugat va xromogen substrat inkubatsiya qilinadi va rangli mahsulot shakllanishi ijobiy gibridomani ko'rsatadi. Shu bilan bir qatorda, immunotsitokimyoviy, [2] Western blot va immunoprecipitatsiya- mass-spektrometriya skriningidan ham foydalanish mumkin. G'arbiy blot-tahlillardan farqli o'laroq, immunoprecipitatsiya- mass-spektrometriya antigen oqsillarining mahalliy (denaturatsiyalanmagan) shakllari bilan bog'langan klonlarni skrining va reytingini osonlashtiradi. [3] ■

■ Multiwell plitalari dastlab gibridomalarni o'stirish uchun ishlatiladi va tanlanganidan keyin kattaroq to'qima kolbalari bilan almashtiriladi. Bu gibridomalarning farovonligini saqlaydi va keyingi tekshiruvlar uchun kriyoprezervatsiya va o'ta yuqori darajadagi hujayralarni ta'minlaydi. Kultivatsiya supernatantidan 1 dan 60 mkg / ml gacha bo'lgan monoklonal antikor hosil bo'lishi mumkin, u zarur bo'lganda -20 ° C yoki undan past darajada saqlanadi. [2] ■ Kultivatsiya supernatantidan yoki tozalangan immunoglobulin preparatidan foydalanib, potentsial monoklonal antikorni ishlab chiqaruvchi gibridomani keyingi tahlil qilish reaktivlik, o'ziga xoslik va o'zaro reaktivlik nuqtai nazaridan amalga oshirilishi mumkin. [2] ■ Monoklonal antikorlardan foydalanish

■ Diagnostik gistopatologiyada ■ Monoklonal antikorlar yordamida to'qima va organlarni to'qima yoki hujayra genezisini aks ettiruvchi ma'lum belgilangan markerlarni ko'rsatishi asosida tasniflash mumkin. Prostata o'ziga xos antijeni , platsenta ishqoriy fosfataza , inson xorionik gonadotrofini , a-fetoprotein va boshqalar organlar bilan bog'liq antijenlerdir va bu antigenlarga qarshi monoklonal antikorlarni ishlab chiqarish birlamchi o'smaning xarakterini aniqlashga yordam beradi. [2] ■ Monoklonal antikorlar, ayniqsa, morfologik o'xshash lezyonlarni farqlashda juda muhimdir plevra va peritoneal mezotelyoma , adenokarsinoma va farqlanmagan organ yoki to'qima kelib chiqishini aniqlashda metastazlar . Tanlangan monoklonal antikorlar aniqlashda yo

■ hish bilan bog'liq bo'lgan monoklonal antikorlardan foydalangan holda immuno-sitokimyada yashirinlikni aniqlash qobiliyati yaxshilanganiga qaramay ko'krak bezi saratoni suyak iligi aspiratlari va periferik qon tarkibidagi hujayralar, uni muntazam ravishda ishlatishdan oldin ushbu usulni yanada rivojlantirish zarur. [5] Immuno-sitokimyoning muhim kamchiliklaridan biri shundaki, faqat o'smaga bog'liq bo'lgan va o'ziga xos bo'lmagan monoklonal antikorlardan foydalaniladi va natijada normal hujayralar bilan o'zaro reaktsiya paydo bo'lishi mumkin. [6] ■ Ko'krak bezi saratonini samarali tarzda bosqichma-bosqich o'tkazish va ildiz hujayralarini autolog infuzion qilishdan oldin tozalash rejimlarining samaradorligini baholash uchun, hatto kichik

■ Buning asosiy sabablaridan biri metastatik relaps bo'lgan bemorlarda qattiq o'smalar malign hujayralarning erta tarqalishi. Sitokeratinlarga xos bo'lgan monoklonal antikorlardan (mAb) foydalanish suyak iligidagi tarqalgan individual epiteliy o'simta hujayralarini aniqlashi mumkin. ■ Bitta ish [8] sitokeratin komponentini bir vaqtning o'zida etiketlash uchun immuno-sitokimyoviy protsedura ishlab chiqilganligi to'g'risida hisobotlar. 18 (CK18) va prostata o'ziga xos antijeni (PSA). Bu prostata saratoni bilan og'rigan bemorlarda tarqalgan epiteliya o'simta hujayralarini keyingi tavsiflashda yordam beradi. Prostatitning benign gipertrofiyasi bo'lgan bemorlarning o'n ikki nazorat aspirati salbiy binoni ko'rsatdi, bu esa suyak iligidag

■ Ghosh, Meyson va Spriggs [9] zararli kasallikka chalingan 41 bemorning plevra yoki qorin parda suyuqligining 53 namunasini tahlil qildi. An'anaviy sitologik tekshiruvda neoplastik hujayralar aniqlanmagan. Xavfli hujayralarni izlash uchun uchta monoklonal antikor (anti-CEA, Ca 1 va HMFG-2) ishlatilgan. Immunotsitokimyoviy yorliq 18 oygacha -20 ° C darajasida saqlanib qolgan, bo'yalgan smearlarda o'tkazildi. Immuno- sitokimyoviy binoni qilingan qirq bitta holatning o'n ikkitasida malign hujayralar aniqlandi. Natijada o'sishni anglatadi diagnostika aniqligi taxminan 20%. Tadqiqot xulosasiga ko'ra, xavfli xastalikka shubha qilingan bemorlarda sitologik jihatdan salbiy namunalarni tekshirishda immuno-sitokimyoviy yorliqdan muntazam foydalanish kerak va bemorni boshq

■ Bir tadqiqotda monoklonal antikor (IgM, k izotipi) ishlab chiqaradigan gibridoma hujayra liniyasining (klon 1E10) ajratilishi haqida xabar berilgan. Ushbu monoklonal antikor nukleollarning o'ziga xos immuno-sitokimyoviy bo'yashini ko'rsatadi. [11] ■ Monoklonal antikorlar yordamida to'qimalarni va o'smalarni ma'lum markerlarning ifodalanishi asosida tasniflash mumkin. Ular morfologik jihatdan o'xshash lezyonlarni ajratishda va differentsiyalanmagan metastazlarning organ yoki to'qima kelib chiqishini aniqlashda yordam beradi. Tanlangan monoklonal antikorlar bilan suyak iligi, to'qima aspiratlari, limfa tugunlari va boshqalarni immuno-sitologik tahlil qilish yashirin metastazlarni aniqlashga yordam beradi. Monoklonal antikorlar hatto oz miqdordagi invaziv

■ Гибридома (лат. hibrida, hybrida помесь + -oma) — злокачественная клетка, полученная путем слияния (гибридизации) опухолевой клетки с ее нормальным аналогом, унаследовавшая от злокачественной клетки способность к неограниченному росту,а от нормальной клетки способность к синтезу специфического белка, чаще всего антитела. ■ Впервые в 1975 г. Кёлер (G. Kohler) и Милстайн (С. Milstein) показали, что индивидуальные клоны (см. Клон ) антителосекретирующих клеток могут быть превращены в бессмертные при слиянии с миеломными клетками. В результате возникает линия злокачественных клеток, способных к бесконечному росту в культуре или в организме и продуцирующих антитела (см.) заданной специфичности. ■ Спонтанное слияние клеток происходит исключительно редко. Однако практически любые клетки мож

■ Теоретической основой метода селекции является следующее. Главный путь биосинтеза пуринов и пиримидинов может быть блокирован антагонистом фолиевой к-ты аминоптерином. В этом случае клетка может синтезировать ДНК побочным путем, зависящим от ферментов тимидинкиназы (КФ 2.7.1.21) и гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы (КФ 2.4.2.8), способных обеспечить пролиферацию клетки в присутствии тимидина и гипоксантина. При отсутствии одного из этих ферментов синтез ДНК прекращается. Клетка может избежать этого путем слияния с другой клеткой, способной снабдить ее недостающим ферментом. Т. о., если добиться слияния нормальной клетки селезенки, к-рая обладает активностью тимидинкиназы и гипоксантин-фосфорибозил-трансферазы с миеломной клеткой, лишенной активности этих ферментов и потому погибающей пр

■ Для того, чтобы гибридная клетка могла проявить себя как функционально дифференцированная клетка, обе родительские клетки должны находиться на примерно одинаковых стадиях дифференцировки, в противном случае гибридная клетка быстро теряет эту способность. Поэтому для получения Гибридом, способных секретировать антитела, нормальные антител ©секретирующие клетки (В- лимфоциты) сливают только с миеломными клетками (для облегчения отбора нужных клонов используют мутантные миеломные клетки, не только лишенные гипоксантин- фосфори-бозилтрансферазы, но и не секретирующие иммуноглобулины). Для получения Г., сохраняющих функцию Т-лимфоцитов (см. Иммунокомпетентные клетки ), последние сливают с мутантными клетками тимомы. Г. клеток печени получают слиянием нормальных клеток эмбриональной или взрос

■ Обычные антисыворотки содержат антитела, продуцируемые клетками сотен и даже тысяч клонов. При этом многие антитела направлены против антигенов, случайно присутствующих в иммунизирующем материале, и нежелательны для экспериментатора. Препараты многих высокоактивных биол. веществ, напр, гормонов, трудно очистить от балластных белков, содержание к-рых в этих препаратах в тысячи раз выше, чем содержание гормонов. Все это ограничивает возможности обычной серологии. Гибридомная технология решила эти трудности — с ее помощью могут быть получены любые количества практически гомогенных моноклональных антител, даже если иммунизирующий материал не очищен. ■ В конце 70-х гг. 20 в. получены первые Г. человека, выделена мутантная линия миеломных клеток, лишенных гипоксантин-фосфорибозилтрансферазы. О

■ Наиболее трудна процедура отбора клонов, секретирующих заданные антитела. Клетки сразу после слияния весьма ранимы и плохо растут вне организма. Требуется достаточная плотность клеток в культуре, что достигается с помощью различных питательных подслоев клеток типа тимоцитов, макрофагов, к- рые в культуре не размножаются (так наз. фидеров). Даже в этих условиях необходимо вырастить определенную массу гибридных клеток, к-рая, однако, не должна быть слишком велика, т. к. обычно несекретирующие клетки растут быстрее секретирующих и вытесняют последние. Поэтому получение любой Г. нуждается в быстром тестировании продуцирующих антитела клонов и в повторном клонировании с отбором нужных клонов. Следует учитывать, что гиб-ридомные клетки нестабильны и около половины отобранных клонов гибнет, что

■ От каждой мыши можно получить до 10 мл асцитной жидкости, содержание антител в к-рой такое же, как и в сыворотке крови. Т. о., гибридомная технология позволяет получать практически неограниченные количества высокогомогенных антител, не нуждающихся в очистке. ■ Продуцируемые Г. моноклональные антитела применяют во многих областях биологии и медицины. Так, их используют для изучения тонкой структуры белков, радиоиммунол, определения гормонов, тестирования тканей на гистосовместимость, определения антигенов на поверхности различных клеток, для определения локализации и для классификации опухолей и гемобластозов, для иммунотерапии злокачественных заболеваний (иногда соединенные с токсинами), для хроматографической очистки молекул соответствующих антигенов и т. д. ■ С помощью гибридомной техн

Купить