Информация о документе

Цена 9000UZS
Размер 324.9KB
Покупки 0
Дата загрузки 24 Сентябрь 2019
Расширение doc
Раздел Дипломные работы
Предмет Биология

Продавец

Bohodir Jalolov

Ҳайвон ҳужайраларини ўстиришга оид замонавий маълумотлар

Купить
Ҳайвон ҳ ужайраларини ўстириш га оид замонавий маълумотлар МУНДАРИЖА КИРИШ…………………………………………………………………….3 БОБ. Фойдаланилган адабиётла шархи…………………… 2 - БОБ. Тадқиқот усуллари........................................................................ Ҳайвон ҳужайраларини ўстириш жараёни тарихи Културага (озуқа мухитига) хужайрани киритиш In vitro шароитида ўстириладиган ҳужайраларнинг хусусиятлари Хулоса....................................................................................................... Фойдаланилган адабиётлар рўйхати.................................................... Битирув малакавий ишнинг долзарблиги . Юксак тузилишга эга ҳайвонлар тўқималаридан ҳужайраларни ажратиб олиб in vitro шароитида ўстириш ва кўпайтириш учун шароит яратиш ҳақидаги билимлар ва ғоялар XX асрнинг биринчи ўн йилликларида вужудга келган. Қишлоқ хўжалиги ҳайвонларини муваффақиятли равишда клонлаш ишлари дастлаб 1986 йилда С.Уилладсин (S.Willadsen) томонидан амалга оширилган. У 8 та ва 16 та ҳужайрали қўй эмбриони ҳужайралари ядросини, ядроси олиб ташланган бластомерга кўчириб ўтказган. С.Уиладсин (1989 йил) томонидан 32-ҳужайрали муртак битта бластомерини рецепиент тухум ҳужайрасига ўтказиш орқали 4 та генетик ўхшаш бўлган холстейн зотига мансуб буқалар олинган. Муаллиф томонидан кўпчилик ядролар 32-ҳужайрали босқичигача тотипитентлик хусусиятини сақлаши қайд қилинган, бунда уларн 4.Ҳайвон ҳужайраларини бошқа биологик агентлардан эркин ҳолатда ушлаб туриш ва in vitro шароитида тинимсиз ўстиришни таъминловчи усуллар. Ишдаги янгилик. Биотехнология фани янги фанлар жумласига кириб бизнинг шаротимизда “Ҳайвон ҳужайраларини ўстиришга оид замонавий маълумотлар” устида деярли ишлар олиб борилмаган. Бу соҳага оид ўзбек тилидаги қўлланмалар ҳам жуда кам. Мен битирув малака ишимни ёзишда инглиз ва рус тилида ёзилган, дунёнинг замоновий лабораторияларда олиб борилаёган ишлар ва уларнинг услублари тўғрисида янги маълумотлар келтирдим. Қўлланилиш соҳаси. Ушбу битирув малакавий ишдан коллеж, мактаб ўқувчи ва ўқитувчилари ҳамда шу соҳага қиқувчилар қўлланма сифатида фойдаланишлари мумкин. АДАБИЁТЛАР ШАРХИ Юксак тузилишга эга ҳайвонлар тўқималаридан ҳужайраларни ажратиб олиш ва in vitro шароитида ўстириш ва кўпайтириш учун шароит яратиш ҳақидаги билимлар ва ғоялар XX асрнинг биринчи ўн йилликларида вужудга келган. Шундай кейин маълум бўлдики, бунга ўхшаш жараёнларни ҳақиқатдан амалга ошириш мумкин ва ишларнинг иккинчи босқичи бошланди, яъни фильтрланувчи-инфекцион агентлар ҳисобланган вирусларнинг ҳужайраларини ўстириш ва репродукциясини амалга ошириш имкониятлари намойиш қилина бошланди. Бу тарихнинг учинчи босқичи ҳайвон ҳужайраларида кўп миқдорда вирус материалини олиш ва ундан эмлаш препаратлари тайёрлашда фойдаланишдан тортиб, 1) ҳужайрага специфик экзоген олинган генларни киритиш ва уларни экспрессиялаш; 2) культурада якка ҳужайрадан бутун бир популяцияни ўстириш имкон 4.Ҳайвон ҳужайраларини бошқа биологик агентлардан эркин ҳолатда ушлаб туриш ва in vitro шароитида тинимсиз ўстиришни таъминловчи усуллар. Бу усулнинг ишлаб чиқилишининг илмий асосини ҳужайранинг тирик организмлар - ҳайвон ва ўсимликлардан олинган асосий структура элементи эканлигидан келиб чиқади. Ҳайвон тўқималаридан ҳужайраларни ажратиб олиш ва in vitro шароитида ўстириш ва кўпайтириш шароитларини яратиш концепцияси Клод Бернарга тегишли ҳисобланади. У фақатгина тирик организмлар ташқи муҳит ўзгаришларига боғлиқ ҳолатда ички муҳити доимийлигини сақлаш хусусиятига эга эмаслигини таъкидлаган. Ҳайвон организмидан ташқаридаги ҳужайра ҳам ўзининг ички шароитларини ушлаб туришга ҳаракат қилади. Бунда ташқи ва ички шароитлар ўртасидаги фарқ кам бўлса, у ҳолда ҳужайранинг бўлиниш ва ўсиш эҳтимол Ру нинг ишларини давом эттириб, Росс Харрисон « осилиб турувчи томчи » усулини такомиллаштирган. У бақада лимфа тромблари хосил бўлган медулляр томирларидан ажратиб олинган, унча катта бўлмаган тўқима парчасини қоплағич ойнанинг пастки томонига ўрнатиб, предмет ойнасига юқорига қаратиб жойлаштирган. 1907 йилда у ушбу кўринишдаги «камера» ёрдамида асаб ҳужайраларининг ўсишини бир неча ҳафта мобайнида кузата олган; у бу ҳужайраларнинг ўсиш тезлиги 25 минутда 20 мкм ни ташкил қилинишни аниқлаган. Бу вақтда, Харрисон тажрибаларидаги каби масала ечимига ойдинлик киритиш мақсадида бақа асаб ҳужайраларида ишлаши билан биргаликда Барроуз каби тадқиқотчилар иссиққонли ҳайвонлар тўқима ҳужайралари устида хам тажрибалар олиб борган. Бу тадқиқотчи 1910 йилда лимфа тромби билан биргаликда товуқ плазма қилинадиган шароитлардан келиб чиқиб, контаминациянинг олдини олиш учун мураккаб эҳтиёт чораларини таъминлаши натижасида ўстирилаётган матерал атрофида жараённи тўхтаб қолишига олиб келмайдиган атмосфера хосил қилинади. Бунда анчагина муваффақиятларга эришилган. Жумладан, антибиотиклар мавжуд бўлмаган шароитда хам ҳужайраларни кўчириб ўтқазишда жарроҳлик техникаси қоидаларидан фойдаланиш, ҳужайранинг янги шароитга мослашишида бир қатор натижаларга эришган. Каррель шунингдек, ўзининг жамоаси билан биргаликда ҳужайраларни кўчириб ўтқазишнинг илмий асосларини намойиш қилишга ҳаракат қилган. Олиб борилган ишлар натижасида культура муҳитини олиш жараёнига бир қатор ўзгартиришлар ва қўшимчалар киритилган. Жумладан, Тирод томонидан Рингер эритмаси таркибини бироз ўзгартириб, товуқ зардоби ва эмбр кўпайтирилганда чекланиши исботланган. Ҳужайралар линияси популяцияси нобуд бўлишидан олдин қариш хусусиятига эга. Бироқ бу ҳужайралар нобуд бўлишидан олдин диплоид ҳолатда қолади ва хеч қандан саратон ўсимталари ҳосил бўлиши белгилари кузатилмайди. Саратон ўсмаларидан ажратиб олинган ҳужайралар ёки ўстириш жараёнида трансформацияланган ҳужайралар «умри боқийлиги» билан тавсифланади ва гетероплоидлиги билан корреляцияланади. Ҳайвон ҳужайралари суспензия ҳолатидаги культураси дастлаб ўсма тўқималари ҳужайралари асосида яратилган. Бу ҳужайра – HeLa одам бачадони саратон ўсмасидан ажратиб олинади. 1952 йилда Джеем ва унинг ходимлари томонидан бачадон карционома ҳужайралари линияси ажратиб олинган ва ундан ҳозирги кунда дунёнинг кўплаб лабораторияларида фойдаланилади. Одам диплоид ҳужайраларин ҲАЙВОН ҲУЖАЙРАЛАРИНИ ГИБРИДЛАШ УСУЛИНИНГ ЯРАТИЛИШ ТАРИХИ ХIX бошларига келиб, кўп ядроли ҳужайралар кашф қилингани билан боғлиқ ҳолатда соматик ҳужайралар бир-бирига ёпишиши мумкинлиги таҳмин қилинди. Тарихий нуқтаи назардан, поликарионларнинг кашф қилишига асосланиб, Шлайден томонидан янги ҳужайралар цитоплазматик пуфакча ички қисмида она ҳужайра авлоди юзага келиши ҳақидаги нотўғри фаразлари юзага келган. Бу фикрдан фарқли равишда, Рудольф Вирхов томонидан 1851 йилда кўп ядроли ўсма ҳужайраси тасвири тасвирланган ва ишонарли тарзда ҳужайра ичида эндоган муртаклар янги ҳужайраларнинг бошланғичи деб таъкидланган. Бундан ташқари, поликарион ҳужайраларнинг кашф қилиниши ҳужайра назарияси билан кураш оловига ёқилғи сепди. Бу назарияга қарши бўлганлар томонидан олдинга сурилган гипотезага бино олиш мумкинлиги аниқланган. Бунда қўшилишни чақирувчи модда сифатида инактивацияланган HVJ вируси, яъни Сендай вирусидан фойдаланилган. Шу вақтга қадар Сендай вируси тажрибаларда ҳужайраларни ёпиштиришда кенг миқёсда ишлатилади. Пролиферация хусусиятига эга бўлган, турлар ўртасидаги гибрид ҳужайраларни ўрганишда қуйидаги иккита жуда муҳим ҳолатлар кузатилган: - гибридларда ҳар иккала геном намоён бўлади; - узоқ ват давомида яшовчи, турлар ўртасидаги гибридларда битта турга хос хромосомалар элиминацияси амалга ошади. Ҳужайралар қўшилиши учун қанақадир таъсирловчи шарт эмас. In vivo шароитида хам in vitro шароитида бўлгани каби, махсус моддаларни қўшмасдан туриб хам ҳужайраларнинг ўзаро қўшилиши юзага келиши мумкин. Шунга қарамасдан, бу кўринишдаги барча қўшилишлар спонтан ҳолатда, онтогенез мева тана юзага келади. Табиий шароитларда сут эмизувчилар ҳужайраларида хам қўшилиш жараёни кузатилиши мумкин. Масалан, мушак тутамлари хосил бўлишида ҳужайралар қўшилиши қайд қилинган. XIX асрда кўндаланг-тарғил мушакларда миофибриллалар поликарион – йирик, чўзинчоқ шаклдаги, кўп ядроли ҳужайралардан ташкил топганлиги таъкидланган. Поликарионлар – бир ядроли миобластларнинг қўшилишидан хосил бўлган. Ўсма ҳужайраларининг қўшилиши - одатий ходиса ҳисобланиб, натижада in vivo шароитида ўсма ҳужайралари баъзан нормал ҳужайралар билан хам қўшилиши қайд қилинади. Ҳужайраларнинг ўз- ўзидан, спонтан равишда қўшилишини in vitro шароитидаги тажрибаларда ўрганиш устида тадқиқотлар олиб борилган. Бу кўринишдаги тажрибаларда тўқималарида турли хил геотипга эга бўлган ҳужайралар мавжуд бўлган, " х 1.Агрегацион усулда химераларни олиш бир вақтнинг ўзида, бир- биридан ҳабари бўлмаган тарзда, Варшав ада Тарковски й ва Филадельфи яда Минц томонидан ишлаб чиқилган (1961-1962 йиллар ). Бунда ҳомиладор урғочи-донорлар бачадонидан 8 та блостомерга эга бўлган муртак ажратиб олинган. Бластомерлар иккита турли хил генотипга эга бўлган ҳайвонлардан (масалан, оқ ва қора тусли сичқонлардан) олиниб, уларнинг агрегацияси амалга ошишини таъминловчи шароит яратилган муҳитга солиниб, 16-ҳужайрали муртак хосил қилинган. Бу таркибдаги муртак in vitro шароитида бластоцитлар босқичигача ривожланади, кейин эса уларни қабул қилувчи она организми бачадонига кўчириб ўтказилади, бунда маълум бир гормонлар ёрдамида ёлғондакам ҳомиладорлик юзага келтирилади. Натижада эса аллофен сичқонлар хосил қилинади. Бунда с бошқарилиш механизмлари хам қайд қилинган. Ушбу усулнинг қулайлиги – микрожарроҳлик техникасини талаб қилмайди, шу сабабли эмбриогенетика соҳасида кенг қўлланилади. 2. Инъекцион усул – 1968 йилда Р. Гарднер томонидан ишлаб чиқилган. Бу усулда бластоциста босқичидаги эмбрионлардан фойдаланилади. Бластоцисталар микроманипуляторлар ёрдамида бирлаштирилади, бунда инъекция йўли билан донор бластоцистлар ҳужайра ички массаси рецепиентнинг эмбриони бластоцелига киритилади. Бу усул билан нафақат эбрион дастлабки босқичларида ҳужайра ички массасини кўчириб ўтказиш мумкин, балки нисбатан дифференциаллашган ҳужайраларни хам кўчириб ўтказиш имконияти мавжуд. Инъекцион усул турлар орасида химераларни олишда кенг қўлланилади. Дастлабки турлар орасидаги химера, ўзаро ўхшаш бўлган, бироқ одатда чатишмайди фақат инъекцион усул ёрдамида хосил қилинган. 1984 йилда турлар орасидаги химералар қўй ва эчкилар ўртасида амалга оширилган ва қўй-эчки хосил қилинган, бу тажрибалар бир вақтнинг ўзида Англия ва Германия давлатларида амалга оширилган. Бунда ҳар иккала усулдан хам фойдаланилган. Жинсий йўл билан эчки ва қўйлар чатишмайди, чунки бунда турлар орасида хромосомалар тўплами турли хилда: эчкида 2n = 60, қўйда 2n = 54 ҳолатда бўлади. Германияда 1985 йилда швиц (жигарранг) қорамол зоти ва голштин-фриз зотлари ўртасида 32 ҳужайрали эмбрион асосида агрегацион химера бузоқча олинган. Бу химера бузоқча фенотипига кўра ҳар иккала она авлод белгиларини ўзида мужассамлаштирган – жигарранг ва қора-ола-чипор тусли рангларни акс эттирган. Химера ҳайвонлар ўзидан генетик жиҳатдан мозаик хоссага эга авлод қол ҲАЙВОН ҲУЖАЙРАЛАПИНИ ЎСТИРИШ ШАРОИТИ ВА УСЛУБЛАРИ Ҳужайрани тўқима ёки организмдан ажратиб олиб, культура муҳитига жойлаштирилгандан кейин ҳужайра учун in vivo шароитидаги каби ташқи шароитлар билан таъминлаш зарур. Бу кўринишдаги таъминот ҳужайрани яшовчанлиги ортишига, пролиферацияси ва ихтисослашувига олиб келади. Ҳужайра ташқарисидаги муҳит ҳужайрани озуқа ва гормонал омиллар ва шу каби ҳужайранинг ҳаётчанлиги ва ўсиши учун керакли бўлган барча омиллар билан таъминлаши керак. Ҳайвон ва одам ҳужайралари культураси аниқ бир ҳолатдаги фазаларни, яъни суюқ (озуқа муҳити), газсимон (газлар концентрацияси) ва қаттиқ (субстрат юзаси) фазаларни талаб қилади. Озуқа муҳити – биологик келиб чиқувчи компонентлардан (плазма қўшимчалари, қон зардоби, тўқима экстракти ва шу кабилар) иборат аниқ бир т Бу ерда, mi эриган i- модданинг концентрацияси (моль/кг), xi молекуласи диссоциацияланган молекуланинг заррачалари сонини ифодалайди. Масалан, Эрл эритмаси учун осмольяллик қиймати 310,6 мос моль/кг га, ҳақиқий қиймати 283 га тенг. рН диапазони ва осмольяллиги кўпаяётган ҳужайраларда тор доирада ва ҳужайра типига боғлиқ бўлади. Масалан, одам диплоид фиробластлари WI38 клон ҳолатида ўсиши учун оптималь рН қиймати рН=7,30+0,15 ва осмоляльлик қиймати 285+40 мосмоль/кг ни ташкил қилади, жўжа эмбриони фибробластлари учун эса бу қийматлар мос равишда 7,12+0,18 ва 300+20 ни ташкил қилади. Кўпчилик муҳитлар учун рН қийматини сақлаш мақсадида бикорбанатли буфердан (HCO 3 =CO 2 +OH) фойдаланилади, агар СО 2 ажралса ОН концентрацияси ортади. Кам миқдордаги бикорбанат буфер сақловчи эритмалар (Хенкс э Дульбекко DME муҳити ёки DMEM (Игл муҳитининг иккиланган модификацияси). Турли ҳил типдаги ҳужайраларни ўстиришда фойдаланилади, жумладан трансформацияланмаган ҳужайралар ва гибридлар учун қўлланилади. Зардобсиз муҳитлар учун асос ҳисобланади. Таркибида аминокислот, глицин, серин, пируват, термирнинг икки ҳиссали концентрацияси мавжуд. Бу муҳитдан фойдаланиш учун 10% ли концентрациядаги СО 2 инкубатори талаб қилинади. Исков муҳити IMDM - Дульбекко муҳитининг модификацияси . Таркибига алмашинмайдиган аминокислоталар, биотин, витамин В 12 , селенит натри й қўшилган. Муҳитга HEPES қўшилган ва NaCl, NaHCO 3 концентрацияси камайтирилган. Муҳит зардобсиз, одатда лимфоцитлар ва қон ҳужайраларини ўстириш учун қўлланилади. МакКоя 5А муҳити ва RPMI серия ли муҳити . МакКоя 5А муҳити 1958 йилда, Уолк Зардоб етарлича мураккаб таркибли аралашма ҳисобланиб, таркибида майда ва йирик молекулалар мавжуд ва ҳужайралар ўсишини тезлаштириш ва сусайтириш хусусиятларини намоён қилади. Зардобнинг асосий функцияларига қуйидагилар киради: ҳужайра ўсишини, функцияларини таъминловчи гармон омилларга эга бўлиши; ҳужайранинг бирикиш ва қатламланиши омилларини таъминлаш; гормонлар, липидлар, минерал моддлар ва бошқалар ташилишини таъминловчи ташиш оқсилларини таъминлаш. Ҳужайра бўлинишини бевосита жадаллаштиришда махсус йўллар орқали иштирок этувчи зардоб оқсиллари ўсиш омиллари деб аталади. Кўпгина ўсиш омиллари зардоб таркибида бир неча нанограмм-мл ва ундан кам концентрацияларда мавжуд бўлади. Улардан баъзи бирлари ҳужайранинг дифференциацияси маълум босқичларида таъсир кўрсатса, баъзи бирлари эса фақ альбумин бажаради. Темир ташилишини трансферрин бажаради, ўстирилаётган кўпчилик ҳужайралар юзасида бу оқсил учун рецептор мавжудлиги аниқланган. Бирикиш ва қатламланиш омилларига ва коллаген ва фибронектин киритилади, шунингдек нисбатан ихтисосшаган хондронектин (хондроцитлар адгезияси) ва ламинин (эпителиаль ҳужайралар адгезияси) кабилар мавжуд. Охирги йилларда ҳужайраларни кўпайтириш учун зардобсиз муҳитлар ишлаб чиқилган. Бунда ушбу муҳитлар тор доирада ихтисослашган бўлиб, яъни фақат маълум турдаги ҳужайралар учун мўлжалланган. Асос муҳити таркибига инсулин, трансферрин, гидрокортизон ёки унинг аналоги ҳисобланган дексаметазон ва бошқалар киритилади. Зардобсиз муҳитлар ўзига хос хусусиятларга эга ҳисобланади: муҳит таркибининг нисбатан барқарорлигига кўра, тажриба натижалари махсулдор эмизувчиларнинг кўплаб ҳужайралари пролиферация жараёнига киришишдан олдин ва ҳужайралар моно қаватини хосил қилиш учун дастлаб субстратга ўрнашиши ва унда қатламлар хосил қилиши керак бўлади. Шунга боғлиқ ҳолатда талабга жавоб берадиган материал масаласи туғилади. Субстрат сифатида ҳозирги вақтда бир нечта материаллар ишлатилади. Шишалардан нисбатан энг яхшиси пирекс (алюминоборосликатли шиша) ҳисобланади, бунда натрийсликатли таркибга эга шишалар муҳитни ишқорийлигини ошириши мумкин ва уни фойдаланишдан олдин кучсиз кислота қўшилган ҳолда қиздириш талаб қилинади. Ҳар бир ишлатилгандан кейин бу кўринишдаги шиша материалнинг яроқлилик қиймати пасайиб боради. Пластик материаллардан кўпроқ полистирол, поликарбонат, поливинилхлорид, тефлон ва бошқалар ишлатилади. Металлардан эса зангламайдига Культурага ҳужайрани киритиш, уларнинг келиб чиқиши . Қўйилган мақсад ва тажриба вазифаларига қараб ҳайвон ҳужайраларини ўстиришда ишлар иккита йўналишда олиб борилади: - ҳужайралар культураси ; - орган ва тўқималар культураси (орган культур алари ). Ҳужайра культураси структуравий ташкилланишдан ҳоли ҳисобланиб, ўзига хос гистиотип тузилишини йўқотиб боради ва маълум шароит таъминлаб берилмаган ҳолатда биокимёвий белгилари ўзгариб боради ва мувозанат ҳолатига эриша олмайди. Культурада ҳужайра кўпаяди, ҳужайраларнинг миқдори ортади ва улар идентификацияланади (селектив муҳитда ўстириш йўли билан фенотипик ва генотипик белгиларига кўра) идентик параллел йўналишда ривожлана бошлайди. Ўстирилаётган ҳужайралар динамик хусусиятига кўра қийин назорат қилинади, шунингдек in vitro шароитида in vi ҳужайраларнинг етилиши, шунингдек қайтмас ҳолатдаги дифференцировка жараёни культура муҳитида қипиқланувчи ҳужайраларга боғлиқ ҳолатда амалга ошади. Культура учун қандай тўқимани олиш қулай ҳисобланади, вояга етган ёки эмбриональ, нормал ёки ўсма тўқималариними? Эмбрион тўқималаридан олинган ҳужайралар культурасида ҳаётчанлик жуда яхшилиги ва вояга етган тўқимага нисбатан фаол ўсиш кузатилади. Бунга сабаб ихтисослашувнинг паст даражада бўлиши ва эмбрионда репликация хусусиятига эга бўлган ҳужайраларнинг мавжудлиги ҳисобланади. Вояга етган ҳужайраларда пролеферация хусусияти паст ҳисобланади, уларнинг таркибида ихтисослашган ва бўлинмайдиган ҳужайралар кўпчиликни ташкил қилади. Хосил қилинган дастлабки вояга етган ҳужайралар культураси ва уларнинг кўпайиши мураккаб вазифа ҳисобланиб, бу кўр «Умрбоқийлик» хусусияти асосан ўсмалар асосида олинган ҳужайраларга хос ҳисобланади. Доимий ҳолатдаги ҳужайралар линиясининг хосил бўлиши морфологик белгиларга кўра (ҳужайра ўлчамларининг камайиши, уларнинг адгезия хусусиятларининг сусайиши, думалоқ шакл юзага келиши, ядро/цитоплазматик нисбат ортиши, ўсиш тезлиги ортиши (ҳужайраларнинг икки ҳисса ортиши вақти культурада 12-36 соат давомида 36-48 гача камаяди), зардобга боғлиқ хусусиятларининг сусайиши, клон хосил қилиш самарадорлиги бўйича кўрсаткичларининг ортиши, субстратга боғлиқ хусусиятларининг сусайиши, гетероплоидлик хусусиятларининг ортиши (ҳужайралар ўртасида хромосомалар бўйича фарқлар) ва анеуплоидлик ва ўсма хосил қилиш хусусиятлариинг ортиши кабилар бўйича константланади. Нормал ҳужайралар доимий линияда трансформацияланиши м агглютинловчи агентлар (лектинлар) ёки қўшни ҳужайраларнинг антитело таъсирига қарши жавоб реакциясида юзага келиши мумкин. Адгезияда субстрат кўп валентли антитело сингари таъсир кўрсатади, хосил бўлган ёстиқчалар эса «адгезия доғлари» деб аталади. Бу доғлар «адгезив оқсиллар»га жуда бой бўлади ва доимо гликопротеидлар тутиб турувчи цитосклет элементларини ажратиб туради. Бу кўринишдаги таъсир натижасида мембраналарнинг «сиқилиши» камаяди ва ҳужайра думалоқ бўлиб қолишдан сақланади. Ҳужайрада адгезия доғлари ўсимталар хосил қилиб, улар ёрдамида аралашиш амалга ошади. Цитоплазма ўсимталари (ёлғон оёқлари, псевдоподиялар) қўшни ҳужайралар мембраналари билан таъсирлашишганда ҳаракатланишни сусайтиради. Бу ҳолатда ҳужайранинг псевдоподиялари бошқа йўналишга томон йўналади (таъсирлашиш орқали бориши кузатилади, бунда ҳужайралар тўплами жойлашган муҳитда қанақадир муҳим бўлган озуқалар ёки ўсиш омиллари етарли бўлмайди. Одатда ўсиш омили муҳитда 10 -10 М концентрацияда мавжуд бўлади (таҳминан 3 мкм диаметрли айлана шаклга эга бўлган битта молекула). Битта фибробластда 105 тага яқин ўсиш омили рецепторлари мавжуд бўлиб, уларнинг ҳар бири юқори даражадаги боғланиш хусусияти билан тавсифланади. Ушбу кўринишда, ҳар бир ҳужайрада етарлича миқдорда рецепторлар мавжуд бўлиб, барча ўсиш омиллари молекулалари муҳитда 150 мкм диаметрли айланани ташкил қилади. Шунингдек, ўсиш омилининг сезиларли даражадаги қисми ҳужайра ташқарисидаги рецепторлар билан боғланишида эндоцитоз орқали жадал сўрилиши ва бузилиши таҳмин қилинади. Бундан маълумки, қўшни ҳужайралар ўзаро жуда кам миқдордаги ўсиш ом Ҳужайраларнинг бўлиниш частотаси уларнинг қатламланиши ортиши билан ортиб боради. Бунда эҳтимол, кучли қатламланган ҳужайралар кўп миқдордаги ўсиш омили молекулаларини ўзига бириктира олиши ёки ўзларининг юзаси катталашиши натижасида кўпроқ миқдорда озуқа моддаларини юта олиши мумкин бўлади. Бироқ, баъзи бир ҳужайра турлари суспензия ҳолатидаги муҳитда деярли пролиферация хусусиятига эга бўлмайди, бунда ҳужайралар сусбстрат билан тегиб турган ҳолатдагина жадал бўлина бошлайди, ҳаттоки бу тегиш соҳалари ҳужайралар бирикиш хосил қилиш даражасида бўлмаган, кичик ҳолатларда хам бу ҳолат кузатилади. Бу кўринишдаги «фокаль» тегиш соҳалари ҳужайра ички актин филаментлари билан ҳужайра ички матрикс молекулалари билан бирикиш жойларида юзага келади (гарчи бевосита бўлмасада). Бу ва шунга ўхшаш бошқ билан боғлиқ ҳисобланади, бунда шунингдек ушбу ҳужайраларнинг культурага киритилишида фокаль тегиш соҳалари камайиши қайд қилинади. Ўстирилаётган ҳужайраларнинг ўсиш хусусиятлари трансформация деб аталади. Трансформация – қайтмас жараён ҳисобланади ва афтидан, хўжайин организмнинг трансформацияланган геномида неопластик фенотип орқали назорат қилинувчи, ирсий ахборот тарзида жамланган генетик ўзгаришларни ўз ичига олади. Ўсиш хусусиятларининг ўзгаришлари мослашиш хусусиятларининг бири ҳисобланиб, ҳужайралар трансформацияланмаган ҳужайралар учун ноқулай бўлган шароитларда пролиферацияга эга бўлишини таъминлайди. Ушбу кўринишда, нормал ҳужайралар ўсиши чекланган шароитларда трансформацияланган ҳужайралар популяцияси зичлиги нисбатан юқори даражагача ўса олади, бу ҳолат фикримизча бу хусусият бўлиб, трансформацияланган ҳужайралар нисбатан яққол намоён бўлади ва нисбатан тўлиқ тавсифланган. Ўз-ўзидан амалга ошувчи трансформацияларга ўхшаш ўзгаришларни ўрганиш натижасида бу кўринишдаги транформация жараёни ҳужайрада трансформациядан олдин вирус геномидаги каби генлар кетма-кетлиги (онкоген) мавжуд бўлганлиги билан изоҳланиб, трансформацияда ушбу генлар фаоллашади. Кўплаб тадқиқотчилар томонидан тасдиқланганки, ўз-ўзидан трансформацияланувчи ҳужайра ДНК занжирида вируслар таъсирида трансформацияга учраган ҳужайралардаги каби генлар кетма-кетлигига эга бўлади. Бироқ, ушбу кўринишдаги ишларнинг бирида қайд қилинишича, бу кўинишдаги аналогик (фарқланмайдиган бўлиши хам мумкин) ҳолатларни нормал генларда нуқтали (нишонланган) мутацияларни чақириш орқали хам юзага келтириш мумкин. Қари ўртасидаги боғлиқлик ва ўстириш муҳитидаги ҳужайраларнинг икки ҳисса ортиш потенциали ўртасидаги боғлиқликлар аниқланмаган. Ҳужайра линияларининг ҳаётчанлик даври чекланиши бўйича мисол қилиб диплоид фибробласт ҳужайраларини кўрсатиш мумкин, бунда ушбу турдаги ҳужайралар саноат мақсадларида фойдаланиш учун идеал ҳужайралар ҳисобланмайди, бунда улардан қаришга боғлиқ жиддий ўзгаришлар юзага чиққунга қадар фойдаланиш мумкин. Амалий жиҳатдан бу шуни англатадики, ушбу ҳужайраларнинг ҳаёт даври мобайнида, саноат мақсадларида 12 ва 30 маротаба экишлар оралиғида (биринчи ҳолатда экиш материалини тайёрлаш мақсадида) фойдаланиш мумкин. Трансформацияланган ҳужайралар ҳаёт даври давомийлиги чекланмаган, бу ҳолат эса улардан биотехнология соҳасида турли хил махсулотлар генерацияси учун субстрат сифати - узиб олиш усулида (ўстирилаётган ҳужайраларнинг бир қисми янги озуқа муҳити билан алмаштирилиб турилади); - доимий усулда (ҳужайралар ўстрилишида ҳажм доимий секин тезликда ўсиб боради ва даврий равишда ҳужайраларнинг бир қисми олиб ташлаб борилади); - перфузион усулда (бир вақтнинг ўзида муҳитга янги муҳит солиб борилади ва шу билан биргаликда тенг миқдордаги ишлатиб бўлинган (ҳужайрасиз) муҳит олиб ташланади). Перфузия очиқ ҳолатда амалга оширилиши, яъни тизимдан барча муҳит олиб ташланиши ва ёпиқ ҳолатда амалга оширилиши мумкин. Ёпиқ ҳолатдаги перфузияда олиб танланаётган муҳит қўшимча идиш орқали ўтказилади ва унинг рН-кўрсаткичи қайтарилади ва аэрация қилинади, кейин эса ўстириш муҳитига қайтарилади. Оқим мавжуд бўлмаган ўстириш муҳити у ёки бу кўринишдаги чиқиндиларнинг йиғилиб қол 1.Муҳитнинг тўлиқ алмаштирилиши осон амалга оширилади ва тоза озуқа муҳити солинишидан олдин ҳужайраларни ювиб ташлаш осон кечади. Бу ҳолат ҳужайралар ўсиши битта шароитда кечаётган ҳолларда муҳим аҳамиятга бўлиб, махсулотларни бошқа шароитга қайта ўзгартиришда, масалан ҳужайраларни зардобли муҳитдан зардобсиз муҳитга ўтказишда қўлланилади. Шунингдек, бунда кераксиз компонентларни тўлиқ олиб ташлаш имкони туғилади. 2. Ҳужайраларнинг юқори зичлигини таъминлайди. 3. Агарда ҳужайралар субстратга маҳкамланган бўлса, кўпчилик ҳужайраларда талаб қилинадиган махсулот экспрессияси самарали кечади. 4. Моно қаватли ўстириш ҳоҳлаган турдаги ҳужайраларда амалга оширилиши мумкин, бу кўринишдаги ўстириш усули тадқиқотларнинг нисбатан ўзгарувчанлигини таъминлайди. 5. Бир қатор ҳолларда, масалан вирусларн 1. Ясси флакон идишларда (матрацларда) ўстириш. 2. Айланувчи шишаларда ўстириш, бунда ҳар 15-20% вақт давомида шиша юзаси озуқа муҳити билан қопланиб туради, ҳужайралар эса даврий равишда ушбу муҳит таркибида ёки ҳавода мавжуд бўлади. 3. Микротарқатувчи мавжуд бўлган колонкаларда ўстириш, бунда зич йиғилган ҳолатдаги, аралашиб кетмайдиган, 35 мм диаметр ўлчамга эга шиша шарикчалар, пластинка дасталаридан ва бошқалардан фойдаланилади, озуқа муҳити сифатида эса улар орқали юқоридан пастга оқиб тушади. Колле чашкаси, тубида ҳужайралар жойлашган ясси флакон Таг деворларида ҳужайралар жойлашган айланувчи шиша (айлана идиш) Микроманбада ҳужайралар жойлашган колонка Муҳит регенерацияси ва тизим назорати Озуқа муҳити компонентлари Шиша буслар Перистальтик насос Умуртқасиз ҳайвонлар ҳужайра ва тўқималарини ўстириш. Умуртқасиз ҳайвонлар ҳужайраларини ўстиришга қизиқиш, уларнинг ўсиши ва метаморфози ўзига хос тарзда ва турли хил кўринишда амалга ошишига боғлиқ бўлиб, бунда ҳужайра ихтисослашуви ва генларнинг фаоллигини назорат қилиш жараёниларида асосий ўрганиш объекти бўлиши мумкин. Бошқа томондан эса энтомапатоген препаратларни яратиш усуллари кўриб чиқилганда, вируслар фақат ҳашоротларнинг тирик ҳужайраларидагина кўпая олиши қайд қилинган ва шу сабабли вурусларга қарши препаратлар яратишда хўжайин-ҳашорот ҳужайраларини ўстиришга талаб юзага келади. Умуртқасиз ҳайвонлар ҳужайраларидан фойдаланиш қуйидаги масалалар ечимига олиб келиши мумкин. Ҳашоротлар ҳужайра ва тўқималарини ўстиришда фойдаланиладиган муҳитлар таркибига кўра ўзаро бир-биридан кес Органларни ўстириш. Органларни ўстириш - in vitro шароитида орган ёки орган қисмларини организмда мавжуд шароитларга максималь даражада яқинлаштирилган ҳолатда, тўқималарнинг анатомик ва функционал боғлиқликлари сақлаб қолинган кўринишда ўстириш ҳисобланади. Экспланта периферия қисмида алоҳидаланган ҳужайраларнинг миграцияси ўстиришнинг махсус шароитлари таъсирида сусайтирилади, натижада эса дифференциаллашган тузилмалар юзага келиши мумкин. Масалан, ўпка тўқималари эксплатаси перифериясида альвеолалардан ташкил топган, ботиқ бронхиаль эпителийли, янги, майда бронхлар ривожланади. Органларни ўстиришда ҳужайралар орасидаги ўзаро алоқалар сақланиб қолади, узоқ вақт мобайнида гистологик ва гистокимёвий дифференцировка сақланади, шунга боғлиқ ҳолатда бир неча кун ёки ҳафта давомида ҳужайралар уларнинг қисмлари, териси бўлмаган ҳолатда суюқ муҳитдагига нисбатан қаттиқ муҳитда яхшироқ ўсиши аниқланган. Бунда субстрат сифатида нимадан фойдаланиш мумкин? Органларни ўстиришнинг бир нечта техникаси турлари мавжуд. Субстрат сифатида плазма суртмасидан фойдаланиш мумкин. Бу усулни Фелл ва Робинсон таклиф қилган бўлиб, " соат ойнаси техникаси " номи билан танилган, бу усул морфогенетик таҳлил йўналишида эмбрион органларини ўстиришда классик усул ҳисобланади (28-расм). Бунда ўстириш жараёни соат ойнаси устида суртма юзасида амалга оширилиб, суртма таркиби жўжа плазмаси ва товуқ эмбрион экстрактидан ташкил топган. Соат ойнаси Петри чашкасига ўрнатилади ва тепасидан нам пахта билан бекитилади ёки қуриб қолишининг олдини олиш мақсадида фильтр қоғози билан бекитилади. Ўстириш жараёни қилинган ( 3 -расм). Бу усул 1 - 4%ли концентрациядаги агарли гелни олишга асосланган, бунинг асосида буфер тузли эритмалар ёки эмбрион зардоби қўшилган, 199 типидаги озуқа муҳитидан фойдаланилади. 3 -расм. Агарли суртмали соат ойнаси усули (Вольф ва Хафен, 1952 бўйича ). 20-асрнинг ўрталарига келиб Чен томонидан соат ойнаси юзасида суюқ муҳитда сузиб юрувчи қоғоз парчаси устида ҳужайраларни ўстириш усули аниқланган. Кейинчалик усулни такомиллаштириш мақсадида қоғоз парчаси устки қисми силикон билан ишлов берилган, шунингдек миллипора фильтр билан бирлаштирилган, кейин эса визкоза ацататдан фойдаланила бошланган. Бу материал ацетонда яхши эрийди ва тўқимани гистологик таҳлил қилишда тайёргарлик ишларини осонлаштиради. Сузиб юрувчи қоғоз парчаларида ўстириш усули бир қатор камчиликларга эга Модификацияланган Троувелл усули (И.Ласнитски, 1989 бўйича ). 1976 йилда одамнинг етилган тўқималарини, бронх эпителийси ва сут безлари, ошқозон ва бошқаларни узоқ вақт давомида ўстириш учун суюқ муҳитда ва газли фазада навбат билан ўстириш усули таклиф қилинган. Бунинг учун экспланта пластик идиш тагига маҳкамланади ва муҳит билан ёпилади. Идишлар аниқ бир таркибга эга газли камерага жойлаштирилади, камера эса чайқалувчи платформага ўрнатилади. Ҳужайраларни ёпиштириш механизми Ҳужайраларни қўшишни чақириш учун турли хил табиатли моддалардан фойдаланилади. Са 2+ ионлари, полиэтиленгликоль, лизолецитин, глицерин моноолеат, Сендай вирус кабилардан фойдаланилади. Лизолецитин – юзада фаоллик кўрсатувчи, липид табиатли модда бўлиб, фосфолипаза А таъсирида лецитин деградацияси махсулоти ҳисобла Глицерин моноолеат моддаси хам липид табиатига эга бўлиб, бироқ мембранани бузувчи таъсири нисбатан кучсизроқ намоён бўлади, бироқ бунда ушбу модда ишлатилганда ҳужайраларнинг қўшилиш частотаси спонтан тарздагига нисбатан 4-7 маротабагача ортиши кузатилади. Ҳужайраларнинг қўшилишини чақирувчи сифатида бошқа бир агглютинловчи модда сифатида махсус тажрибаларда ўсимлик лектинлари ва антитело синовдан ўтказилган. Сендай вируси ҳужайраларнинг қўшилишини чақирувчи агент сифатида деярли токсик хусусиятни намоён қилмайди. Вирус фойдаланишдан олдин инактивацияланади, бунда 5 минут давомида махсус лампа орқали ультрабинафша нурланиш билан ишлов берилади, натижада вирус кўпайиш хусусиятини йўқотади, бироқ ҳужайраларни қўшилишини чақириш хусусияти сақланиб қолади. Сендай вирусини ишлатишда иккита кам ҳужайралар мембраналари агглютинацияси амалга ошади, яъни ҳужайралар мембраналарининг ўзаро жуда яқинлашиши уларнинг қўшилиб кетиши учун зарур шароитни яратиади. Полиэтиленгликоль ҳам ҳужайраларнинг агрегациясини юзага келтириб, бунда механизм тўлиқ аниқланмаган. Бунда ПЭГ сувли эритма муҳитида ўзида катта миқдордаги манфий заряд тутиши орқали, молекула ўлчамлари етарлича йирик бўлганлиги сабабли ҳужайралар ўртасида электростатик боғланишларни юзага келтириши мумкин. Бу гипотезанинг тасдиғи сифатида ҳужайраларнинг ПЭГ таъсирида агглютинацияси кучайишини қайд қилиш мумкин: бунда икки валентли ионлар афтидан ПЭГ молекулалари ва ҳужайра мембранаси юзасида жойлашган манфий зарядланган углеводлар ўртасида кўприк хосил қилади. Бош қ а гипотезага биноан, протопластлар дегратация натижасида бирлаш 32 -Расм. Ҳужайранинг ёпишиш босқичлари (Н. Рингертцу, Р. Сэвиджу, 1979 бўйича ): А - 1-босқич, цитоплазматик мембраналарнинг яқинлашиши: 1- гликопротеидлар, 2 - липидлар, 3 - плазматик мембраналар, 4 - митохондрия, 5 - микрофиламентлар, 6 - Сендай вируси қисмлари; Б - 2-босқич, гликопротеидлар чиқиши ва мембрананинг липид қавати бўшаши; В - 3-босқич, мицелла хосил бўлиши; Г - 4- босқичнинг бошланиши, мембраналарнинг ёпишиши, цитопласматик кўприкларнинг хосил бўлиши. Лектинлар ва антитела – икки ёки поливалент бирикмалар ҳисобланиб, уларнинг агглютинловчи функцияси бу моддаларнинг битта молекуласининг иккита ҳужайра юзасида жойлашган рецепторлар билан таъсирлашуви натижасида ҳужайралар орасида боғланиш хосил қилиши билан тушинтирилади. Бундай молекуляр боғларнинг етарлича миқдорда бўлиши н кўп ўрганилган қисмлар ҳисобланади. Мембранада углеводлар нейтрал қанд молекулалари сифатида учрайди, шунингдек улар липид ва оқсил молекулалари билан ковалент боғланишлар хосил қилади. Айнан ушбу кўринишда углеводалар турли хил кўплаб биологик жараёнларда фаол иштирок этади. Гликопротеидлар ҳужайраларда антиген хусусиятнинг юзага келишида аҳамиятга эга бўлиб, физиологик жиҳатдан рН кўрсаткичи нейтрал ҳолатдаги ҳужайралар учун хос бўлган, таркибида манфий заряд сақлайди ва ҳужайрада таниб олиш, адгезияси жараёнларида иштирок этади, агглютинловчи агентлар, бактерия ва вирусларнинг рецептор соҳаларини таниб олиши жараёнида қатнашади, мембрананинг ионларга нисбатан ўтказувчанлиги амалга ошишида хам бевосита иштирок этади. Бу хусусиятлари орқали улар ҳужайралар қўшилишида иштирок этади. Углево молекулалари гидрофил бошчалари билан сув фазасига қараб жойлашади, гидрофоб “дум”, ёғ кислоталари қисми билан эса ички мицелла ички томонига қараб жойлашади. Бу жараён рН кўрсаткичи юқори бўлган ҳолатларда ва кальций ионлари миқдори ортган вақтда юзага келади. Ҳар иккала ҳужайраларда вирус қисмларининг эндоцитози амалга ошади. Тўртинчи босқич – мембраналарнинг қўшилиши. Са 2+ ионлари хосил қилувчи кўприкчалар орқали мицеллар ўлчамлари кичиклашади. АТФ ва Са 2+ таъсири остида микрофиламент лар фаоллашади. Хосил бўлган цитоплазматик кўприк барқарорлашади ва микрофиламентлар функцияси таъсирида кенгаяди. Ҳужайраларнинг қўшилиши охирги босқичида АТФ нинг мавжудлиги муҳим ўрин тутади. Бунда АТФ митохондрия функцияси орқали хосил қилинади. Иккита ёки ундан кўп ҳужайралар қўшилишидан хосил бўлув Ҳужайраларнинг қўшилиши антитело ишлаб чиқарувчи гибрид ҳужайраларни олишга асос бўлади. Антитело – қон зардоби оқсили ҳисобланиб, организмга бегона жисм (антиген) тушган вақтда организмнинг ҳимоя функциясини таъминлаш мақсадида синтезланади. Иммун тизими махсус антителоларни ишлаб чиқариб, кўплаб антигенларга қаршилик хусусиятини намоён қилади. Бу хусусияти асосида кўплаб лимфоцит клонлари тор ихтисослашган йўналишдаги антителоларни синтезлай олади. Иммуноглобулин ( Ig ) деб аталувчи антитело қон таркибидаги асосий оқсиллардан бири ҳисобланиб, умумий массасига кўра плазманинг 20%ини ташкил қилади. Антиген сифатида турли хил моддалар иштирок этиши мумкин: микроорганизм ҳужайралари, вируслар, оқсиллар, нуклеин кислоталар, баъзи ҳолларда антибиотик ёки пестицидлар кўринишидаги қуйи молекуляр Агар антиген молекуласи учта ёки ундан кўпроқ миқдорда антиген детерминантга эга бўлса, у ҳолатда антитело уларни кенг миқёсдаги тўр бўйлаб тикиши кузатилади. Бунда маълум ўлчамга етгандан кейин, бу кўринишдаги тўр эритмада чўкмага тушиши кузатилади: Йирик иммун комплексларнинг чўкмага тушиши (преципитация) тенденцияси антитело ва антигенларни аниқлаш учун қулай ҳисобланади. Бу кўринишдаги комплексларнинг хосил бўлиши, молекулаларнин гаглютинацияси (ёпишиши) натижасида амалга ошиши мумкин. Бу ҳодиса қон гуруҳларини аниқлаш асосини ташкил қилади, яъни эритроцитларннинг ёпишиши антителоларнинг у ёки бу холатдаги спецификлигига боғлиқ ҳолатда гемагглютинация реакцияси орқали амалга ошади. Антитело молекуласи тўртта полипептид занжирдан ташкил топган (33 -расм ). Улардан иккитаси – ўхшаш тарзд ўзгартириши ҳисобига ортади. Шарнир соҳа Н- занжирда жойлашган. Н - занжир шунингдек молекуланинг “дум” қисмини хосил қилиб, бу жойда битта ёки бир нечта олигосахарид занжирлар мавжуд, бироқ уларнинг функцияси аниқланмаган. L -занжир каби Н -занжирда хам структура такрорланувчи соҳалардан ёки доменлардан ташкил топган бўлиб, уларнинг ҳар бири эркин ҳолатда қайрилади ва йиғинди ҳолатида ягона функционал бирликни (эпитоп) ташкил этади. Бу соҳалар антиген детерминант сифатида аҳамиятга эга бўлиши мумкин, мос равишда бошқа антителолар билан боғланиш хосил қилади. 33 -Расм . А нтител онинг тузилиши. Моноклон антител оларни олиш Антитело қандай хосил бўлади? Иммун жавоб – махсус гормонлар иштирокидаги турли хил лимфа ҳужайраларининг ҳужайралар оралиғидаги ўзаро таъсирлари орқали намоён бўлувчи м таъсирлашишда мураккаб ҳужайралар орасидаги мажмуа антитело биосинтезини бошланиши учун туртки беради. Антителоларни одам эҳтиёжлари учун фойдаланиш, олиш ишлари ҳайвонларни иммунизациялашдан бошлаган. Антигенни бир неча маротаба инъекция қилишдан кейин иммун жавоб стимулятори мавжуд шароитда қон зардобида махсус антителолар йиғилади. Антитело қон зардобига g -глобулин кўринишидаги фракциялар ҳолида ажратилади, бунда қон зардоби аммоний сульфат, спирт, ПЭГ ва бошқа бир қатор моддалар таъсирида чўкмага туширилади. Хосил қилинган антитело таркибида кўплаб оқсил аралашмалар мавжуд. Антителони юқори даражада тозалаш ион алмашинув хромотография усули орқали амалга оширилади. Стандарт препаратларни олиш анчагина қийин ҳисобланади, бунда уларнинг таркиби ҳайвон турига боғлиқ бўлиб, унинг хусусий Ҳайвонларда антиген киритилишига жавобида, яъни сичқонлар танасига антиген киритилганда В-лимфоцитлар антитело ишлаб чиқариши фаоллашади ва иммунизация амалга ошади. Бу ҳужайралар фақат ҳўжайин организмида яшаши мумикн, уларни сунъий равишда озуқа муҳитига кўчириб ўтказилганда нобуд бўлиши кузатилади. Агар иммун ҳужайраларни ўсма ҳужайралари билан қўшилса, хосил қилинган гибрид ҳужайра сунъий муҳитда чекланмаган муддатли яшаш хусусиятига эга бўлади. Бир вақтнинг ўзида улар антитело синтезлаш хусусиятини сақлаб қолади. Маълум турдаги антителоларни синтезлайдитган гибридомалар селектив ўстириш озуқа муҳитларида танлаб олинади. Кейин эса улар ўстириш муҳитига жойлаштирилади, бу жойда кўпайиб, кўп миқдордаги она ҳужайраларга ўхшаш ҳужайраларни хосил қилади (клон). Бу кўринишдаги клонлар монокл макромолекулалар, ҳужайра қисмлари ёки бутун ҳужайраларни идентификациялашда кучли восита сифатида фойдаланилишига олиб келади. Антителолардан кенг миқёсда диагностик мақсадларда фойдаланиш 1955 йилда америкалик иммунолог А.Кунс тадқиқотларидан кейин бошланган. У антителога шуълаланувчи буёқни бириктирган. Бунда антителонинг флуоресценцияси натижасида унинг молекулалрининг ҳужайра қисмлари бўйлаб жойлашишини кузатиш имконини берган. Бу усул иммунофлюоресцент усул номи билан танилган. Усулнинг сезгирлигини бир неча йўллар билан ошириш мумкин. Биринчи ҳолатда иммун жавоб бир неча тартибдаги антителолардан фойдаланиш орқали амалга оширилади: Антиген тагликка махкамланади (иммобилланади) ва унга 1-тартибдаги антитело қўшилади, бу антитело антиген билан бевосита боғланади. Ўрганилаётган намунаг А. Агар биотин антитело билан бевосита ковалент боғ орқали боғланса, у ҳолатда стрептавидин нишон маркер сифатида фойдаланилади ва 2- тартибдаги антителога аналогик тарзда ишлатилади: Б. «Биотин-антитело+стрептавидин+ нишонланган биотин» тизими : Бу ҳолатда нишонланган биотин билан боғланган стрептавидин молекулалридан иборат бутун тўр хосил бўлади. Ўз навбатида сигналнинг кўп маротаба кучайтирилиши юзага келади. Биринчи ва иккинчи тартибдаги антителолардан фойдаланиш, бевосита суртмадаги микроорганизмларни аниқлаш жараёнини хам осонлаштиради. Бунда барча бактерияларга қарши нишонланган антитело бўлиши шарт эмас. Одатдаги қуён ёки сичқон антителоси қизиқтирган микроорганизмга нисбатан ва нишонланган МКА ушбу иммуноглобулинларга нисбатан қўлланилади. Агар микроорганизм суртмада мавжуд бўлса суртма люминесцент микроскоп остида қаралганда шуъланиш кўринишига эга бўлади. Фотометрик ёки флуоресцент усуллар барча ҳолатларда қўлланилиши мумкин эмас, масалан агар ўрганиш жараёнида жуда ҳира муҳит олинса юқоридаги усуллардан фойдаланиш деярли ҳеч қандай натижа бермайди. Бўёқлардан ташқари нишон сифатида ферментлардан хам фойдаланиш мумкин (иммунофермент таҳлил) ёки радиоактив изотоплардан фойдаланиш мумкин (иммунорадиологик усул). Маркернинг детеция сезгирлик қиймати таҳлил усулининг сезгирлигига бевосита боғлиқ ҳисобланади. Радиоактив нишонлар. Маркерни танлаш ва уни антигенга боғлаш таҳлилнинг энг муҳим қисмларидан бири ҳисобланади. Бунда дастлаб америкалик тадқиқотчилар томонидан (С.А.Берсон, Р.С.Ялоу, 1959 йил). таклиф қилинган радиоизотон нишонлар (радиоиммун таҳлил – РИТ) усули Иммунофермент таҳлилда антиген полистирол сирт ўйиқча соҳасига боғланади. Антитело мавжуд бўлган ўйиқчага нишон сифатида фермент қўшилади, инкубацияланади ва ювилади. Кейин эса бу фермент билан таъсирлашувчи субстрат ювилганда фермент билан таъсирлашиши орқали ранги ўзгариши асосида баҳо берилади. Ранг ўзгаришларини спектрофотометр ёрдамида аниқлаш мумкин. Бу усул ёрдамида биорганик бирикмаларнинг миқдорий баҳоланиши 10-12 г/литр сезгирликда индикацияси амалга оширилади. Ҳозирги вақтда 2000 дан ортиқ турли хил ферментлар маълум бўлиб, фақат улардан баъзиларигина иммунофермент таҳлилларида қўлланилади. Бу ҳолат фойдаланиладиган ферментларга юқори даражадаги талаблар қўйилиши билан боғлиқ. Бунда фермент юқори фаолликка эга бўлиши керак, унинг реакция махсулотлари эса юқори сезгирликда детекц макромолекула таркибидаги компонентларнинг ферментатив ва иммунологик фаоллигига салбий таъсир кўрсатиши кузатилади. Шунга боғлиқ ҳолатда иммунологик усулларда фермент нишонларни киритишга катта эътибор қаратилади. Бундай усулларнинг бири «гибрид антител о » деб номланган . Бунда ферментатив гидролиз натижасида маълум бир антигенга қарши ва фойдаланилаётган ферментга мос келувчи Fab -фрагмент молекуласи хосил қилинади. Кейин эса гидролиз махсулотлари меркаптоэтанод билан қайтарилади; бунда Fab -фрагментлар қайтар тарзда симметрик қисмлар бўйлаб диссоциацияланади. Қайтарувчи агент молекулаларини олиб ташлангандан кейин молекулалар қайтадан ассоциацияланади, маълум бир антиген ва ферментга специфик хусусиятга эга бўлган антитело гибрид молекулаларини хосил қилинади. Бунда фермент қўшилишида Шунингдек, конъюгатлар барқарлорлиги даражаси ва уларни олиш усуллари ўртасидаги боғлиқлик корреляцияси аниқланмаган. Бироқ, гибрид молекулаларининг юқори даражадаги барқарорлиги уларни амалиётда қўллаш имкониятларини таъминлайди ва радиактив изотоплардан фойдаланилган ҳолатларда антитело ва антиген муносабатларидаги барқарорликни оширади. Лиофилланган ҳолатдаги фермент конъюгатлари ўзининг хусусиятини икки йилгача сақлай олади. Ферментлардан ташқари маркер сифатида субстратлардан хам фойдаланилади. Жумладан, иммунокофактор таҳлилда нишон сифатида АТФ ва НАД қўлланилиб, булар антиген молекуласига аденин қолдиқлари орқали тикилиши ва шу орқали уларнинг ферментлар билан таъсирлашиш хусусиятини сақлаши мумкин. Шунга ўхшаш тарзда, пероксидаза субстратлари (люминол, изолюминол) қўлланилади, бун ФОЙДАЛАНИЛГАН АДАБИЁТЛАР РЎЙХАТИ: 1. Албертс Б., Брей Д., Льюис Дж. и др. Молекулярная биология клетки. Т. 1. М. : Мир, 1994. 2. Артамонов В.И. Биотехнология - агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1989. 160 с. 3. Артамонов В.И. Сельские профессии биотехнологии. М.: Изд-во МСХА, 1992. 127 с. 4. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с. 5. Березин И.В., Клесов А.А., Швядас В.К., Угарова Н.Н., Варфоломеев С.Д., Ярополов А.И., Казанская Н.Ф., Егоров А.М. Инженерная энзимология. // Биотехнология. Кн. 8. М.: Высшая школа, 1987. 143 с. 6. Герасименко В.Г. Биотехнология. Киев: Выща школа, 1989. 343 с. 7. Гринберг К.Н., Кухаренко В.И., Ляшко В.Н., Терехов С.М., Пичугина Е.М., Фрейдин М.И., Чериков В.Г. Культивирование фибробластов человека для диагно 14. Спиер Р.Е., Адамс Г.Д., Гриффитс Дж.Б. и др. Биотехнология клеток животных. М.: Агропромиздат, 1989. Т. 1, 2. 15. Тартаковский А.Д. Питательные среды для культивирования клеток млекопитающих. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 44 - 63. 16. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М.: Мир, 1989. 318 с. 17. Фридлянская И.И. Получение моноклональных антител (гибридомная технология). // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 194 - 205. 18. Цуцаева А.А., Петренко Т.Ф. Криоконсервация культивируемых клеток животных. // Методы культивирования клеток. Л.: Наука, 1988. С. 63 - 69. 19. Wilmut I. et al. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cell line // Nature. 1997. V.385. P. 810-813.
Купить