Иммобилизация антиоксидантных ферментов
![ГЛАВА I . СОВРЕМЕННЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ И ПРОБЛЕМЫ
ФИЗИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИММОБИЛИЗАЦИИ ФЕРМЕНТОВ В НАНО-
И МИКРОСФЕРАХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)
1.1. Активные формы кислорода и окислительный стресс
Активные формы кислорода АФК, представляют собой
высокореакционные, преимущественно радикальные, кислородные
соединения, которые образуются в результате неполного восстановления
молекулярного кислорода или изменения спина одного из его электронов,
находящихся на внешних орбиталях [1, 503]. К ним относятся синглетный
кислород, супероксидный анион-радикал, гидроксильный радикал,
пергидроксильный радикал, пероксид водорода (таблица 2.1).
Подавляющее количество молекулярного кислорода (более 95%) в
нормальных условиях потребляется в клетке митохондриальным ферментом
цитохромоксидазой. За счет сокращения воздействия свободных радикалов и
увеличение потребления продуктов, богатых антиоксидантными ферментами,
или добавки с антиоксидантными ферментами, потенциал нашего организма
в снижении риска свободных радикалов связанные со здоровьем проблемы
становится более ощутимым [ 3, 3 ]. Следовательно, антиоксидантные
ферменты абсолютно важны для поддержания оптимального клеточного и
системного здоровья и благополучия.
Известно, что во время обмена веществ в организме
высокореакцонноспособные соединения, называемые свободными
радикалами, генерируется в организме; однако они также могут быть
занесены из окружающей среды. Эти молекулы по своей природе
нестабильны, поскольку они обладают неподеленной парой электронов и,
следовательно, становятся очень рекционноспособными. Они реагируют с
молекулами в клетке, такими как белки, липиды и углеводы. В результате
этого жизненно важные клеточные структуры и функции теряются и в
конечном итоге приводят к различным патологическим изменениям.
12](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_12.png?v=1)
![Таблица 1 .1
Основные виды АФК [2 , 48]
Вид Символ Химическая реакцияτ1/2 при
37 °С , с Свойства
Синглетный
кислород 1
О
2 10 -6
Мощный окислитель
Супероскид
анион-радикал О
2 ·-
О
2 +ē → О
2 ·-
10 -6
Хороший восстановитель, умеренный окислитель.
Обладает свойствами внутриклеточного мессенжера:
сигнальный механизм при взаимодействии различных
подтипов глутаматных и аспартатных рецепторов,
регуляция активности хлорных каналов, индукция
образования пор в митохондриальной мембране.
Участвует в окислительной модификации SH - и NH 2-
групп низкомолекулярных соединений. Антисептик.
Гидроксил-
радикал ОН ·
О
2 +3ē+3Н +
→ Н
2 О+ОН ·
10 -9
Мощный окислитель. Чрезвычайно активен в реакциях
акцептирования и переноса электронов. Участвует в
окислительной модификации нуклеиновых кислот,
белков и липидов. Диффундирует на очень малые
расстояния.
Перекись
водорода Н
2 О
2 О
2 ·
+ē+2Н +
→ Н
2 О
2 10-100 Оксидант, характеризуется малыми скоростями
взаимодействия с органическими субстратами. Обладает
высокой диффузной способностью. Обладает
свойствами мессенждера: активация факторов
транскрипции NF - кВ, АР-1, редокс-регуляции
экспрессии генов.
Гидропероксил-
радикал О
2 ·
+Н +
→ НО
2 ·
10 -2
Наиболее сильный окислитель. Участвует в регуляции
гемодинамики. Вазодилататор.
13](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_13.png?v=1)
![Известно, что роль свободно-радикального окисления или химически
активные вещества в результате окислительного стресса доказана в
патогенезе более чем 100 заболеваний и патологических состояний таких как
ревматоидный артрит, атеросклероз, геморрагический шок, диабет,
сердечнососудистые заболевания, рак, кистозный фиброз, метаболические
нарушения, СПИД, желудочно-кишечный ульцерогенез,
нейродегенеративные заболевания, и другие [4,287 ; 5,245; 6,298; 7,4; 8,2;
9,131; 10,88; 11,241; 12,102; 13, 406].
Некоторыми конкретными примерами заболевания, опосредованного
АФК, являются болезнь Альцгеймера, Болезнь Паркинсона, окислительная
модификация липопротеидов низкой плотности при атеросклерозе, рак,
синдром Дауна и ишемическое реперфузионное повреждение различных
тканей, включая сердце, мозг, почки, печень и желудочно-кишечный тракт
[14, 36; 15, 658; 16, 1].
Обеспечение защиты клеток от повреждающего действия перекисей и
свободных радикалов функционирующего в нормальных условиях организма
осуществляется во-первых снижением образования АФК путем уменьшения
в клетке молекулы кислорода или его более быстрого использования
дыхательной цепью, во-вторых работой антиоксидантной системой [17, 1819;
18, 1175; 19, 658]. Как уже известно, антиоксидантные ферменты играют
жизненно важную роль во многих процессах метаболических реакций и
принимают активное участие при поддержании окислительно-
восстановительного гомеостаза [20, 47; 21, 477; 22, 601; 23, 481].
Система антиоксидантной защиты организма включает неферментные
и ферментные антиоксиданты, к которым относятся супероксиддисмутаза
(СОД1), дисмутирующая супероксид-радикал в кислород и пероксид
водорода, а также каталаза, окисляющая пероксид водорода до
молекулярного кислорода и воды.
2 H
2 O
2 каталаза
→ 2 H
2 O + O
2( 1.1 )
14](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_14.png?v=1)
![Развитие окислительного стресса при воспалительных заболеваниях
обусловлено, прежде всего, снижением активности естественных
антиоксидантных ферментов и дефицитом природных антиоксидантов.
Перспективным является использование этих антиоксидантных ферментов
для снижения окислительного стресса при разных патологиях. При этом
важно получение формуляций, предохраняющих включенные ферменты от
действия защитных систем организма и способствующих их доставке в
целевые органы и ткани [ 24, 6644 ].
Известно, что в результате нормального клеточного метаболизма
живыми организмами вырабатываются АФК. Концентрация АФК влияет на
протекание физиологических клеточных процессов, при этом при высоких
концентрациях они вызывают разрушение и неблагоприяно влияют на
модификации компонентов клетки. При высоких концентрациях АФК и
нарушением дисбаланса между ним и антиоксидантами приводит к
окислительному стрессу. Основными АФК имеющим физиологическое
значение супероксидный анион-радикал (O 2-
), гидроксильный радикал (•OH)
и перекись водорода (H
2 O
2 ) [25, 95].
Длительное воздействие АФК может привести к повреждению
структуру клеток, что в свою очередь вызывает соматические мутации.
Для защиты организма от АФК используется система ферментативных
антиоксидантнов, СОД, глутатионпероксидазу, глутатионредуктазу, каталазу
и неферментативные низкомолекулярные антиоксиданты, например,
глутатион, витамины C, D и E (рис. 1.1).
Рис 1.1. Схема антиоксидантной системы в организме
15](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_15.png?v=1)
![Таким образом, окислительный стресс являющийся одним из главных
факторов, предотвращает повреждений тканей и клеток.
1.2. Антиоксидантные ферменты и антиоксидантная система организма
Антиоксиданты – представляют собой группу биологически активных
соединений, нейтрализующих в организме свободные радикалы, АФК. Они
способствуют защиты мембраны клеток от вредных эффектов, а также
реакции, вызывающих избыточное окисление в организме.
Ферментативные высокомолекулярные антиоксиданты, такие как
супероксиддисмутаза (СОД) и каталаза, способны многократно вступать в
реакцию с субстратом. Лечение с растворами на основе нативных ферментов
малоэффективно, так как фермент быстро инактивируется. Поэтому
необходимо создать систему доставки, обеспечивающее продолжительное
действие после его введение. Для этого необходим носитель,
обеспечивающий защиту фермента и облегчающий их транспорт и доставку
их к месту действия.
Система антиоксидантной защиты организма включает неферментные
и ферментные антиоксиданты, к которым относятся супероксиддисмутаза
(СОД1), дисмутирующая супероксид-радикал в кислород и пероксид
водорода, а также каталаза, окисляющая пероксид водорода до
молекулярного кислорода и воды. Развитие окислительного стресса при
воспалительных заболеваниях обусловлено, прежде всего, снижением
активности естественных антиоксидантных ферментов и дефицитом
природных антиоксидантов. Перспективным является использование этих
антиоксидантных ферментов для снижения окислительного стресса при
разных патологиях. При этом важно получение формуляций,
предохраняющих включенные ферменты от действия защитных систем
организма и способствующих их доставке в целевые органы и ткани [ 24,
6648 ].
16](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_16.png?v=1)
![Как один из самых важных антиоксидантных ферментов, СОД1 играет
решающую роль в дисмутации супероксид-радикала кислорода. Данный
фермент впервые был обнаружен в 1967 году биохимиком Ирвином
Фридовичом из Университета Дьюка и Джо МакКордом. Способность СОД1
обеспечивать важные средства клеточной защиты от повреждения
свободными радикалами заставил ученых-медиков всерьез присмотреться к
свободным радикалам. В большинстве случаев процесс контролируется
автоматически и количество свободных радикалов не становится крайне
высоким. К счастью, в организме за миллионы лет привыкли справляться со
свободными радикалами и разработали различные схемы для этого [16, 4].
СОД1 ( EC 1.15.1.1) - это металлосодержащий антиоксидантный
фермент из семейства супероксиддисмутаз-ферментов, который катализирует
дисмутацию высокоактивных реактивный супероксид-анион по отношению к
O
2 и менее реакционноспособным частицам H
2 O
2 .
О
2∙ − ¿ + О
2∙ − ¿ + 2 Н + ¿ → Н
2 О
2 + О
2( 2.2) ¿
¿
¿
Супероксиддисмутазы участвуют в системе антиоксидантной защиты
организма, которая, при ее нормальной работе, способна избавляться от
избытка активных форм кислорода и азота, устраняя их негативное влияние.
В данной системе принимает участие множество других молекул, в том числе
каталаза и различные пероксидазы, осуществляющие превращение пероксида
водорода в воду и кислород. В норме концентрация кислорода в различных
тканях человеческого организма составляет 6-175 мкМ [26, 271], а
концентрация O
2 •- в крови составляет 10-200 пМ [27, 1; 28, 222].
Супероксиддисмутазы были обнаружены практически у всех живых
организмов. До сих пор происходит открытие различных форм данного
фермента. Например, Cu,Zn-СОД1, клонированная из Curcuma aromatica
обладает высокой активностью, наибольшей при рН = 7,8, и сохраняет до 50
% своей активности после автоклавирования, обладая термостабильностью в
диапазоне температур 10–80 С [
⁰ 29, 1288 ].
17](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_17.png?v=1)
![Cu,Zn-СОД1 находит широкое применение в различных областях
медицины, промышленности в мониторинге окружающей среды, а также в
косметологии и других областях [29, 10].
В организме млекопитающих существует три формы СОД: цитозольная
Cu / Zn -СОД (СОД1), митохондриальная Mn -СОД (СОД2), и внеклеточная
СОД (СОД3) [31,19163; 32,231]. СОД1 разрушает O
2 -
путем
последовательного окисления и восстановление иона переходного металла в
активном центре в механизме типа пинг-понг с удивительно высокой
скоростью реакции [33, 403]. Все типы СОД связывают однозарядные
анионы, такие как азид и фторид, но были отмечены явные различия в
чувствительности к Fe -, Mn - или Cu / Zn -СОД1. Cu / Zn -СОД1 конкурентно
ингибируется N
3 -
, CN -
[34, 4461] и F - [35, 5520].
Впервые фермент Cu,Zn-СОД1 был выделен в 1939 году из печени и
эритроцитов быка, получив название гемокупреин. Другие названия
фермента возникали по мере его обнаружения в разных источниках
(эритрокупреин, цереброкупреин, гепатокупреин и др.).
Cu, Zn-СОД1 имеет в своем активном центре атомы меди и цинка.
Молекулярная масса Cu,Zn-СОД1 – 32 кДа. В ее первичной аминокислотной
последовательности содержится 308 аминокислот. Она состоит из двух
одинаковых субъединиц, каждая из которых представляет собой бета-листы с
небольшим количеством альфа-спиралей. Субъединицы связаны друг с
другом нековалентными взаимодействиями. Также в молекуле Cu, Zn-
супероксиддисмутазы может присутствовать одна дисульфидная связь для
поддержания четвертичной структуры из двух субъединиц [36, 322]. Ниже, на
рис. 1.2, представлена структура Cu,Zn-СОД1 с ее активными центрами [37,
162].
Для осуществления ферментативного катализа Cu,Zn-СОД1 содержит
близко расположенные активные и связывающие центры. На поверхности
фермента находится канал в форме воронки для отделения активного центра
фермента от растворителя.
18](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_18.png?v=1)
![Рис. 1.2. Структура Cu,Zn-СОД1 человека и ее активный центр в
состоянии Cu(II) [37, 165] ( зеленый шар - атом Cu ; чёрный шар - атом Zn )
Воронка по всей ее длине заряжена положительно, она имеет длину 18 Å и
ширину около 24 Å. По мере приближения к активному центру она сужается
до 2,5 Å. Воронка образована 18-ю аминокислотными остатками и внутри нее
сохраняется непрерывная цепочка молекул воды, которые служат донором
протона в катализе Cu,Zn-СОД1. Благодаря сужению воронки, в нее могут
проникать только маленькие отрицательные ионы.
В активном центре фермента Cu,Zn-СОД1, на дне воронки, находятся
атомы меди и цинка. Ближе к отверстию воронки расположен атом меди, а
цинк находится в ее глубине. Расстояние между атомами меди и цинка
составляет около 6,3 Å. Их связь осуществляется через мостиковый имидазол
аминокислотного остатка гистидина His-61. Кроме того, атом меди
координирован тремя аминокислотными остатками гистидина (His-44, His-46,
His-118) и одной молекулой воды, а атом цинка координирован двумя
остатками гистидина (His-69, His-78) и одним остатком аспартата (Asp81) [ 38,
3 ].
Попадая в каталитический центр, первая молекула супероксид-
радикала замещает воду у атома меди и окисляется до молекулы кислорода,
покидая фермент. Одновременно медь переходит из степени окисления +2 в
степень окисления +1, в результате чего разрывается связь между атомом
19](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_19.png?v=1)
![меди и мостиковым остатком His-61. На второй стадии (3) вторая молекула
супероксид-радикала координируется аминокислотными остатками His-61 и
Asp-143 без образования связи с атомом меди. Затем без образования
химической связи супероксид-радикал переводит медь из степени окисления
+1 в степень окисления +2, в результате чего связь между Cu(II) и His-61
снова восстанавливается, а молекула супероксида превращается в перекись
водорода и покидает активный центр. Фермент снова готов к следующему
циклу. Подробнее механизм катализа изображен на рис. 1.3 [39, 2167].
Рис. 1.3. Механизм дисмутации супероксид-радикала в Cu, Zn-СОД1
[39, 2169].
Каталаза (CAT, EC 1.11.1.6) – это высокомолекулярный (М w 250 кДа,
pI 5,4) антиоксидантный фермент, отвечающий за разложением перекиси
водорода. Это защитный фермент присутствует почти во всех клетках живых
20](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_20.png?v=1)
![организмов, в которых имеется кислород. Фермент расположен
преимущественно в пероксисомах, но отсутствует в митохондриях
млекопитающих клетки [40, 22028].
Каталаза ускоряет разложение или восстановление перекиси водорода
(H
2 O
2 ) в воду и молекулярный кислород, соответственно завершая процесс
детоксикации, имитируемый СОД1 [41,650; 42,192] клетки, где он постоянно
ищет молекулы перекиси водорода. Она относится к ферментам класса
оксидоредуктаз, является хромопротеидом, имеющим в качестве
простетической (небелковой) группы окисленный гемм, и состоит из четырех
идентичных субъединиц с молекулярной массой около 60 кДа, не
обладающих ферментативной активностью [43, 651; 44, 170].
Каталаза может долго сохранять свою высокую активность, почти не
требуя энергии активации, скорость реакции этого фермента лимитируется
только скоростью диффузии субстрата к активному центру [45, 715].
Каталаза обладает бифункциональной активностью, т.е. может
разлагать перекись водорода по двум различным путям. В первом случае
фермент разлагает Н
2 О
2 до воды и триплетного кислорода (каталазное
действие). Во втором случае – катализирует окисление перекисью водорода
различных эндогенных и экзогенных субстратов, например, этанола,
метанола, формиата и других (пероксидазное действие). Каталазное действие
регистрируется при относительно высокой концентрации Н
2 О
2 ,
пероксидазное – при более низких уровнях содержания перекиси водорода в
клетке. Каталаза также действует, как регуляторный белок, связывая
НАДФ•Н и высвобождая его, когда клетка находится в условиях
окислительного стресса. Высвобождение НАДФ•Н из комплекса с каталазой
активирует глутатионредуктазу и стимулирует функционирование
глутатионпероксидазы с удалением Н
2 О
2 [46, 327].
У животных перекись водорода выводится из токсинов с помощью
каталазы. Каталаза защищает клетки от образующейся в них перекиси
водорода. Несмотря на то, что каталаза не играет важную роль для некоторых
21](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_21.png?v=1)
![видов клеток в нормальных условиях, очень важным является в
приобретении толерантности к оксидативный стресс в адаптивной реакции
клеток. Выживание крыс, подвергшихся воздействию 100% кислорода
увеличивалось при внутривенном введении липосом, содержащих СОД1 и
каталазу до и во время экспозиции [47, 170]. Повышенная чувствительность
трансфицированных каталаза-обогащенных клеток к некоторым лекарствам и
оксидантам объясняется свойством каталазы в клетках предотвращать
потребление O
2 , вызванное лекарствами, либо для разложения H
2 O
2 в
кислород, либо для прямого взаимодействие с препаратом [48, 1640].
Каталаза для эффективного ограничения концентрации H
2 O
2 в клетках
подчеркивает его важность также в вышеупомянутых физиологических
процессах как фермент антиоксидантной защиты первой линии. Недостаток
или мутация фермента связаны с различными заболеваниями и аномалиями
[49, 213]. Замоцкий и Коллер связывали окислительное повреждение ДНК и
последующий риск предрасположенности к раку у лиц с генетическим
полиморфизмом и изменениями экспрессий / активности генов в каталазе [50,
12485]. Развитие психического расстройства также является результатом
полиморфизма в гене, кодирующим каталазу [51, 388]. Кроме того, люди с
низким уровнем каталазы (акаталаземия) считаются более
предрасположенными к сахарному диабету 2 типа [49, 18] и иногда
появляются атеросклероз и новообразование [52, 1289; 53, 98].
1.3. Иммобилизация ферментов
Ферменты играют важную роль в соответствующих
биотехнологических процессах в энергетике, пищевой и химической
промышленности [54,100; 55,141; 56,1322] . Однако, чтобы быть прибыльным
на уровне промышленных предприятий, ферменты должны обеспечивать
простоту обращения, стабильность и повторное использование. В связи с
этим, иммобилизация ферментов превратилась в инструмент для получения
надежных промышленных биокатализаторов [57, 1232].
22](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_22.png?v=1)
![Иммобилизация определяется как связывание ферментов в
определенном пространстве, сохраняя при этом свои каталитические
активности и позволяя проводить повторное и непрерывное их использование
[58, 15] .
Существует два основных метода иммобилизации ферментов:
физический и химический.
Физическая иммобилизация ферментов представляет собой включение
фермента в такую среду, в которой для него доступной является лишь
ограниченная часть общего объема. При физической иммобилизации
фермент не связан с носителем ковалентными связями. При физическом
методе иммобилизации фермент не претерпевает структурных изменений,
поскольку он физически прикреплен или зажат опорой в состав. Главное
преимущество этого метода заключается в том, что обездвиженный фермент,
включением или инкапсулированием, почти сохраняет свою начальную
структуру; позволяя его повторное использование и, в большинстве случаев,
повышение стабильности ферментов [59, 75; 60, 5462; 61, 66] . Тем не менее,
основным недостатком является то, что связь между опорами фермента очень
слабая; вызывая «утечку» ферментов при этом биокатализатор работает в
водной среде.
Адсорбция, улавливание и инкапсуляция - наиболее характерные типы
физической иммобилизации.
Химическая иммобилизация возникает при химическом
взаимодействии на структуру фермента в его молекуле с образованием новых
ковалентных связей, в частности между белком и носителем. В отличие от
физической химическая иммобилизация может изменить структуру белка, так
как в этом методе ферменты прикреплены к поверхности и / или внутри
подложки химическими связями, которые могут изменить его форму,
жесткость и агрегатное состояние [47, 199] .
Ковалентное связывание с субстратами и самоиммобилизация
находятся в пределах этих типов иммобилизации.
23](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_23.png?v=1)
![При иммобилизации ферментов путем ковалентного присоединения
белки необратимо связаются к носителе (матрице). Ковалентное
прикрепление обычно обеспечивает самую прочную связь между ферментом
и матрицы по сравнению с другими видами иммобилизации [46, 207] .
Помимо возможности повторного использования, большинство носители
обеспечивают ферменту защитный барьер [48, 1643]. Тем не менее, во многих
случаях используемые носители имеют высокие цены, повышающие
стоимость производства иммобилизованных биокатализаторов [49, 214]; с
другой стороны, без носителя возможна иммобилизация или
самоиммобилизация так как она обеспечивает соединение двух молекул
фермента через бифункциональные сшивающие агенты или просто
сшивающие агенты в отсутствии матрицы. В качестве бифункционального
соединения чаще всего для этой цели используется глутаровый альдегид
( G А) [50, 12486], который представляет собой небольшую молекулу
диальдегида.
Преимуществами самоиммобилизации в общем объеме являются
повышенная удельная активность, более легкое производство, меньшие
производственные затраты, более высокая чистота, меньше помех и / или
загрязнений со стороны носителя и более низкие ограничения массообмена
[51, 400]. Иммобилизованные ферменты без носителя (матрицы) являются
полезными катализаторами в процессах, требующих высокую эффективность
и производительность, где ферменты не могут быть стабилизированы
обычные носители [53, 105].
Хотя существует множество стратегий иммобилизации, ни одна из них
не может полностью удовлетворить все виды требования. Выбор конкретных
стратегий иммобилизации будет зависеть от многих факторов, таких как
ограничения, присущие ферменту и процессу в котором он будет
использоваться [62, 2886] . Таким образом, выбор лучшего способа
иммобилизации ферментов будет зависеть от его применения, а также
24](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_24.png?v=1)
![баланса между себестоимостью и потенциальными возможностями
использования иммобилизованных биокатализатор по назначению.
1.4. Типы иммобилизации без носителя, достоинства и недостатки метода
На сегодняшней день доступно больше ферментов, их можно
экономично производить в промышленных масштабах, что позволяет
создавать улучшенные промышленные биокатализаторы [63, 1305]. Несмотря
на эти многочисленные преимущества использования ферментов, их
промышленное применение часто затруднено из-за отсутствия долгосрочной
стабильности и трудностей восстановления и повторное использование.
Однако для экономической и экологической жизнеспособности эти ценные
катализаторы необходимо эффективно регенерировать и рециркулировать,
что достигается с помощью технологий иммобилизации [64, 6534; 65, 238].
Иммобилизованные ферменты без носителя обычно производятся
путем прямого сшивания растворенных ферментов (CLE s – cross - linking
enzymes ), кристаллизованные ферменты (CLEC s – cross - linking enzyme
crystal ) и агрегированные ферменты (CLEA s – cross - linking enzyme agregates ).
Первая работа о таких структурах была описана Quiocho и Richards [66,
4062], где авторы обнаружили, что иммобилизация может быть осуществлена
с помощью бифункциональной сшивающей химической группой –
глутаровым альдегидом. Эти связанные белки, стали известны как «сшитые
ферменты».
CLE s образуются с белками в растворе, которые связаны вместе
сшивающим агентом, имеющим размеры от 1 до 100 мкм. По сравнению с
нативными ферментами этот тип биокатализатора улучшает их термическую
стабильность, но требует забота о различных факторах, таких как pH среды,
количество сшивающего агента, ионная сила и температура. Тем не менее, у
CLE s есть недостатки, такие как низкая ферментативная активность (обычно
менее 50%), плохая воспроизводимость и низкая механическая стабильность
25](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_25.png?v=1)
![[51, 390]. Эти неудобства были частично преодолены за счет захвата CLE s в
геле матрицы или мембраны [67, 260; 68, 2995; 69, 206] .
Наряду с CLE исследования были направлены на производство CLEC s ,
пригодные для биотрансформации в неводных средах, благодаря высокой
устойчивости к суровым условиям [66,4065; 70,7314]. CLEC s - это
кристаллические белки, связанные вместе со сшивающим агентом. Они
достигли улучшенной механической прочности и высокой устойчивости к
температуре, pH и органическим растворителям и протеолизе [71,31;
72,1583; 73, 87].
Каталитическую активность, полученную с помощью CLEC s , можно
улучшить, контролируя размера кристалла фермента. Было обнаружено, что
минимизация размера кристалла увеличивает сохраняемую каталитическую
активность. Тем не менее, процесс требует кропотливых этапов
кристаллизации белков, что увеличивает стоимость производства [74, 283].
По сравнению с кристаллизацией более дешевый метод для
агрегирования молекул фермента и дальнейшего сшивания является процесс
осаждения белков путем добавления в раствор солей, органические
растворители или неионные полимеры [49,213; 75,82]. Эта идея впервые был
введен с амидазой пенициллина в лаборатории Шелдона [76, 1361] и
впоследствии проданные компании CLEA s Technologies (Голландия).
Сшитые ферментные агрегаты (CLEA s ) получают из неочищенных
осажденных ферментов, образующие твердые частицы, которые остаются
вместе посредством нековалентного связывания. Эти CLEA s остаются
постоянно нерастворимыми после ковалентного связывания с сшивающим
агентом (рис. 1.4) [52, 1289; 76, 1361; 77, 1380].
Использование иммобилизованных ферментов без носителей может
быть полезным для процессов, требующих высокой производительности и
селективности, длительной стабильности для лабильных ферментов, которые
не могут быть эффективно стабилизированными традиционными методами
иммобилизации.
26](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_26.png?v=1)
![Рис. 1.4. Процесс приготовления CLEA s в органическом растворителе
[77, 1380]
Селективность иммобилизованных ферментов, не содержащих
носителей, как CLEC s и CLEA s сильно зависят от конформации кристаллов
или агрегатов фермента [76, 1361]. Кристаллизация или условия агрегации
для получения CLEC s или CLEA s могут изменить селективность и / или
активность биокатализаторов [50, 12489].
Стабильность и активность CLEA s аналогичны как у CLEC s [51, 388;
76, 1362]. Каталитические свойства CLEA s зависят от осадителя. Различные
осаждающие агенты вызывают отчетливые конформации агрегатов
ферментов, что селективность CLEA s сильно зависит от конформации
агрегатов фермента [76, 1362].
Важное преимущество иммобилизованных ферментов, в целом, с точки
зрения экономической эффективности, заключается в простоте их извлечения
и повторного использования в качестве гетерогенных катализаторов путем
27](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_27.png?v=1)
![фильтрации, центрифугирования или, альтернативно, в реакторе с
неподвижным слоем. CLEA s в высшей степени пригодны для вторичной
переработки. Помимо облегчения восстановления и повторного
использования, еще одна важная причина для иммобилизации фермента - это
значительное повышение эксплуатационной стабильности по отношению к
нагреванию и органическим растворителям, которые обычно наблюдается.
Действительно, иммобилизация ферментов в виде сшитых агрегатов
ферментов может привести к резкому увеличению их стабильности при
хранении и эксплуатации [72, 1585].
Поскольку молекулы фермента в CLEA s связаны ковалентными
связами, выщелачивание фермента наблюдается в отсутствие водных сред
даже в суровых условиях, например, в присутствии поверхностно-активных
веществ. Еще одно преимущество иммобилизованных ферментов в целом и
CLEA s в частности состоит в том, что они проявляют отсутствие или низкая
аллергенность, так как они не могут легко проникнуть через кожу. Еще одно
важное экономическое преимущество заключается в том, что CLEA s можно
получить из образцов ферментов с низкой чистотой, такая как неочищенный
клеточный лизат, полученный из ферментационного бульона. Кроме того,
поскольку они состоят в основном из активного фермента, CLEA s
демонстрируют высокую производительность катализатора (кг продукта на
кг энзим) по сравнению с ферментами, связанными с носителем, и позволяет
избежать затрат на балласт для носителя.
Размер частиц является важным свойством любого гетерогенного
катализатора, поскольку он напрямую влияет на массу, переносимость и
фильтруемость в условиях эксплуатации. Очевидно, что на скорость
диффузии влияет размер частиц, который определяется, среди прочего,
соотношением сшивающего агента/фермента.
D = kT
6 π η r( 1.3 )
где D – коэффициент диффузии, r – размер частиц, η – вязкость среды.
28](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_28.png?v=1)
![На сегодняшний день технология получения магнитных частиц [78,8;
79,5483; 80,104], а также и возможность управления такими частицами под
влиянием НЧ ПМП [81,1342] позволяет поднять на новый уровень сложности
и актуальности CLEAs путем проведения поперечной сшивки при наличие
магнитных наночастиц.
Использование низкочастотного переменного магнитного поля (НЧ
ПМП) в присутствии МНЧ [81,1342; 82,2255] воздействует на конфигурацию
и активность молекул ферментов [83, 12182]. Взаимодействие МНЧ с
низкочастотным магнитным полем описывается двумя важными и
конкурирующими между собой релаксационными процессами: неелевской и
брауновской релаксациями [84, 1548]. При нееловской релаксации
происходит диссипация энергии магнитного поля, и, следовательно, нагрев
наночастицы в связи вращения магнитного момента МНЧ относительно
кристаллической структуры частицы. В брауновской релаксации МНЧ
вращаются вместе с магнитным моментом, проявляя магнитомеханический
эффект [81, 1343; 85, 44]. В этом случае также будет происходить нагрев
системы, однако этим нагревом можно пренебречь, так как теоретические
оценки показывают, что разогрев магнитным полем частотой 50 Hz состоит
не более 10 -4
К [86, 26]. В зависимости от частоты магнитного поля, свойства
частиц и окружающей среды может преобладать один из описанных
процессов.
Технология CLEAs в последнее десятилетие успела доказать свою
практическую полезность и промышленную жизнеспособность в отраслях
нанобиотехнологии, медицине и промышленности. Это было особенно
успешен в иммобилизации различных ферментов для использования в
превращении углеводов, от моно- до полисахаридов в водной среде, что
позволяет переработку ферментов. В настоящее время применение сшитых
агрегатов в промышленном биокатализе получает дальнейшее ускоренное
развитие, продолжающимся переходом к более устойчивой, основанной на
биологии, экономике замкнутого цикла, в которой растет тенденция к
29](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_29.png?v=1)
![использованию углеводов в качестве заменителя углеводородного сырья. Мы
ожидаем сохранить эту тенденцию и в будущем, и усовершенствовать
методику получения и применения «умных» m - CLEAs в процессах конверсии
углеводов как в традиционной переработке пищевых продуктов, так и в
производстве биотоплива, товарной химии и полиэфиров и полиамидов на
биологической основе из отходы возобновляемой биомассы, в медицине и
диагностике.
1.5. Карбонат кальция и его полиморфные формы
1.5.1. Структура полиморфных форм карбоната кальция
Как уже отметилась ранее, значительный разброс частиц по размерам в
CLEAs , а также высокая концентрация фермента в препарате, что приводит к
возникновению внутридиффузионных затруднений для транспорта субстрата
[87, 93; 88, 1204; 89, 6354].
Потенциальным путем преодоления этих недоста тков может являться
синтез CLEA s внутри некоторой пористой матрицы с ее последующим
удалением. Весьма перспективным в этой связи выглядит ватерит - одна из
полиморфных форм карбоната кальция [90, 2410]. Сферические
микрочастицы ватерита получают простым осаждением СаСО
3 из растворов
CaCl
2 и Nа
2 СО
3 [91, 601], причем размеры и диаметр внутренних пор таких
микрочастиц легко контролируются температурой и продолжительностью
синтеза [92, 795]. Было показано, что наличие в растворе молекул полимеров
(в том числе белков) приводит к их эффективному включению в ватерит
[93,456; 94,2; 95,975; 96,141]. Более того, включенные в поры матрицы
молекулы обладают весьма зaметной подвижностью, что было
продемонстрировано на примере полимеризации поли( N -
изопропилакриламида) и 4-акрилоилбензофенона с образованием
термочувствительног геля [97, 314]. Наконец, ватеритную матрицу легко
растворить закислением среды или добавлением хелатирующих агентов
(например, ЭДТА), высвобождая тем самым включенное в нее содержимое
30](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_30.png?v=1)
![[97, 314; 98, 1543]. Это приводит к образованию пористых частиц,
представляющих собой обратную реплику матрицы ватерита.
Одним из наиболее распространенных минералов, образующийся в
природе является карбонат кальция. Карбонат кальция входит в состав
горных пород и океанических отложениях. Он играет большую роль в
процессах, протекащих в живых организмах. СаСО
3 стабилизирует уровня
углерода в окружающей среде. В промышленности карбонат кальция находит
широкое применение при производстве строительных и полимерных
материалов. В сельском хозяйстве применяется для удобрения почв. В
последние годы используют в качестве пищевых добавок при производстве
пищевых продуктов. В связи с этим, карбонат кальция и его полиморфные
формы представляет большой интерес в качестве объектов изучения.
В зависимости от различных физико-химических факторов могут
образоваться различные полиморфные модификации, такие как 1. аморфный
карбонат кальция (АКК), включающий несколько форм с различным
содержанием воды [87,101; 99,59; 100,2772; 101,1455 102,11560; 103,3729;
104,1204; 105,415]; 2. две гидратированные кристаллические формы
(гексагидрат или икаит CaCO
3 ·6 H
2 O и моногидрокальцит CaCO
3 · H
2 O ) [99,60;
102,11560; 105,415; 106,5769; 107,797], которые редко образуются в природе;
3. три дегидратированные кристаллические полиморфные модификации
(кальцит, арагонит и ватерит) [99,86; 100,2774; 102,11562; 105,415; 108,18;
109,160]. Эти полиморфа карбоната кальция различаются кристаллической
структурой, внешним видом кристаллов и физико-химическими свойствами
(растворимостью в воде, плотностью, пористостью и рядом других).
Формирование того или иного полиморфа зависит от выбора способа
получения частиц и обусловлено сочетанием многих условий реакции
(концентрации исходных реагентов, температуры растворов, значения их рН
и т.д.). Образование зародышей и рост кристаллов ватерита представляют
большой интерес, так же как и механизм формирования кристаллических
частиц ватерита.
31](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_31.png?v=1)
![В настоящее время для получения других полиморфных форм
карбоната кальция и его трансформации используют АКК [110,1633;
111,276]. Известно [101,1456; 106,5768; 108,22; 112,1050; 113,2758; 114,1018;
115,2934; 116,121; 117,11605], что АКК состоит из обогащенной кальцием
сетки, состоящей из сферических частиц диаметром 30-200 нм (средний
диаметр 90 нм), с порами, содержащими воду и ионы ( р ис. 1 .5 ). Поры-каналы
диаметром 1 нм объединены ионами Ca 2+
и пронизывают насквозь структуру
АКК.
Рис. 1 .5. СЭМ фотографии АКК (А -В), состоящего из сферических
или агрегированных наночастиц с неровной поверхностью [104, 1204].
Гексагидрат (CaCO
3 ·6H
2 O) был обнаружен в биологических отлажениях
в форме бипирамидальных кристаллов. Гексагидрат имеет моноклинную
кристаллическую решетку (таблица 2.2) [106, 5768; 105, 415], устойчивую в
узком интервале температур ≤ 20°С. При температуре около 0°С икаит
устойчив, а при увеличении температуры быстро трансформируется в ватерит
или кальцит [102, 11562; 106, 5768]. Моногидрат (CaCO
3 ·H
2 O) впервые был
получен в лаборатории методом дегидратации кристаллов икаита и в природе
практически не встречается [102, 11563; 106, 5769; 118, 38]. Моногидрат
нестабилен и кристаллизуется в гексагональной (тригональной) системе
( т аблица 2.2) [105, 415; 106, 5769].
Кристаллические дегидратированные полиморфные формы (кальцит,
арагонит и ватерит) различаются кристаллической структурой, внешним
видом кристаллов и физико-химическими свойствами (растворимостью в
32](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_32.png?v=1)
![Таблица 1 .2 .
Кристаллическая структура полиморфных форм CaCO
3
[89, 6360; 90, 2415; 92, 796; 105, 415; 106, 5769; 119, 2415]
Полиморфная форма Пространственная
структура Элементарная ячейка*
Моногидрат СаСО
3 ·Н
2 О Р З
1 12 Гексагональная (триганальная) ( Z=3)
Гексагидрат СаСО
3 ·6Н
2 О С2/с Моноклинная ( Z= 2 )
Кальцит RЗc, RЗrc Гексагональная ( Z = 6 )/
ромбоэдрическая ( Z =3, тригональная)
Арагонит Pmcn Ромбическая ( Z= 4 )
Ватерит P З
2 21 и Р З
1 2 (или Р6
3 / mmc ) Гексагональная ( Z= 6 ) ,
неупорядоченная)
C2 Моноклинная ( Z= 2 )
* Z - количество формульных единиц в элементарной ячейке.
33](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_33.png?v=1)
![воде, плотностью, пористостью и рядом других). Формирование того или
иного полиморфа зависит от выбора способа получения частиц и
обусловлено сочетанием многих условий реакции (концентрации исходных
реагентов, температур растворов, значения их рН и т.п.). на рис 1 .6 и 1 .7
представлены типичные полиморфные формы карбоната кальция и
схематическое изображения их криссталических решеток.
Рис. 1 . 6. Типичные дегидратированные полиморфные формы карбоната
кальция: А – кальцит (22 ч, 30 °С), Б – кальцит (22 ч, 10 °С), В –
арагонит, монокристаллические иглы (15 мин, 90 °С), Г – арагонит (22 ч,
30 °С), Д – ватерит (16 мин, 30 °С), Е – ватерит (16 мин, 30 °С). Шкала 10
мкм [120, 314].
На основании приведенных данных видно, что полиморфные формы
карбоната кальция отличается между собой благодаря различному
распределению ионов относительно Ca 2+
внутри кристаллической ячейки.
34](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_34.png?v=1)
![Рис. 1 . 7. Схема кристаллической решетки кальцита, арагонита и
ватерита: А, В, Д - один слой CaCO
3 в плоскости основания
(примитивная элементарная ячейка выделена пунктиром [89, 6361; 98,
1543]) и Б, Г, Е - кристаллическая решетка.
1.5.2. Физико-химические свойства полиморфных форм карбоната
кальция
Согласно литературных данных кристаллические полиморфные формы
различаются внешне, по морфологии и размеру частиц (рис. 2.6), а также
физико-химическим свойствам ( т аблица 1 .3 ).
Произведение растворимости (Ksp) и площадь поверхности
полиморфных форм увеличиваются в ряду кальцит - арагонит - ватерит -
АКК. Кальцит практически нерастворим в воде и не имеет пор [121, 784]. Для
полиморфных форм известны зависимости произведения растворимости
35](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_35.png?v=1)
![Таблица 1 .3
Физико-химические свойства полиморфных форм карбоната кальция
[90,2416; 93,477; 102,11562; 104,1204; 105,415; 119,2413; 123,548; 124,97; 125,1199; 126,4902; 127,1143; 128,109220].
Полиморфная
форма Форма
частиц Размер
частиц, мкм Рефрактив–
ный индекс Твердость
по шкале
Мооса ρ, г/см 3
К
sp , [ М 2
] Площадь
поверхности,
м 2
/г
АКК (стабильная
гидратированная Сферическая 0,2-0,4 - - 2,43 4,0-9,1·10 -7
9,0-19,3
АКК (временная
дегидротированная) Сферическая 0,03-0,3 - - 12,0-43,0
Ватерит Сферическая,
нерегулярная 0,3-70 1,55-1,65 3 2,54-2,65 1,2·10 -8
7,2-40,0
Арагонит Игольчатая,
призма Длина 2-30
мкм,
ширина 3-4
мкм 1,53-1,68 3,5-4 2,93-2,95 1,7-6·10 -9
1,2-3,6
Кальцит Кубическая 1,48-1,66 3 2,71 1,3-12,2·10 -9
0,19-0,99
36](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_36.png?v=1)
![от температуры [120, 314; 121, 785; 122, 60]. Растворимость всех форм CaCO
3
(кроме икаита) уменьшается с увеличением температуры, что нетипично для
органических и неорганических веществ. При 20°С растворимость кальцита и
арагонита в воде равна 6,6 мг/л, а ватерита 11 мг/л. Растворимость АКК в 10
раз превышает растворимость безводных полиморфов.
Изучение механизма поверхностных явлений связана со свойствами
кристаллов . Свойства поверхности кристаллов карбоната кальция зависят от
полиморфной формы и условий их получения. Для определения
устойчивости дисперснқх систем важную роль играет значение Дзета-
потенциал а. Важность дзета-потенциала состоит в том, что его значение
может быть связано с устойчивостью коллоидных дисперсий. Дзета-
потенциал определяет степень и характер взаимодействия между частицами
дисперсной системы. Sawada и др. [129, 922] изучен ы Зависимости ζ-
потенциала кристаллов ватерита и кальцита от концентрации ионов кальция
Ca 2+
.
Установлено, что при равновесии с кристаллами концентрация ионов
карбоната равна log ¿¿
где
Ksp=¿
Заряд поверхности кристаллов сдвигался в положительную сторону с
увеличением концентрации ионов кальция в системе. Кривые ζ-потенциалов
сильно различались между кальцитом и ватеритом. При нормальных
условиях эксперимента (концентрация ионов Ca 2+
равна 10 -3
моль/дм 3
),
поверхность кальцита заряжена отрицательно, а ватерита - положительно,
поэтому отрицательно заряженные соединения адсорбируются на ватерите, а
положительно заряженные - на кальците.
Наиболее распространенный кальцит представляет наименьший
интерес для биомедицинских применений из-за его непористой структуры и,
следовательно, низкой способности загружать лекарство. В отличие от
37](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_37.png?v=1)
![кальцита, кристаллы арагонита и особенно ватерита имеют высокоразвитую
внутреннюю структуру, подходящую для размещения представляющих
интерес молекул различной природы; это во многом определило
использование ватерита в наномедицине.
Ватерит относится к мезопористым материалам, состоящийся из
небольших нанокристалитов, в пространстве между которыми образуется
взаимосвязные цилиндрические поры [124, 99; 130, 101] . Кристаллы ватерита
имеют типичные размеры от 3 до 20 мкм и чаще всего имеют сферическую
форму. В ряде недавних исследований также были предложены новые
способы изготовления нанокристаллов [131, 2944; 132, 90; 133, 3089]
необходимых для приложений доставки лекарств. Форму и морфологию этих
кристаллов можно регулировать в широком диапазоне, используя
органические растворители [132, 91] или мягкие смешанные системы вода-
мочевина [134, 52680] полимерные матрицы и белки [131, 2942] или
наночастицы [135, 577]. Пористость кристаллов можно контролировать,
изменяя температуру приготовления без каких-либо ограничений.
Мезопористая структура ватерита позволяет включать в поры
различных инкапсулятов от небольших молекул таких как анастетиков [136,
909], антибиотиков [137, 1192], противораковые препараты [138, 23] , до
макромолекул таких как белки [94, 2; 95, 975], гены [139, 4; 140, 57] и
факторов роста [141, 1210].
Загрузка молекул в ватерит может выполняться в мягких условиях либо
во время роста кристаллов соосаждением или совместным синтезом [135,
577; 142, 306 ] либо посредством последующей загрузки в предварительно
сформированные кристаллы ватерита посредством адсорбции в
кристаллические поры [142, 306] или недавно внедренным методом
сублимационной сушки [143, 1283] . Среди этих подходов адсорбция и
совместный синтез - два основных метода инкапсулирования лекарств.
Адсорбция представляет собой наиболее «мягкий» метод, подходящий для
инкапсуляции лабильных молекул, склонных к агрегации, денатурации и
38](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_38.png?v=1)
![потере активности в агрессивных средах. [93, 470; 95, 979 ] . Напротив, при
соосаждении смешивание раствора лекарственного средства с солями-
предшественниками приводит к более эффективное улавливание и
однородное распределение молекул внутри кристаллов при их росте. Однако
из-за более жестких условий роста кристаллов (высокая ионная сила и
повышенный pH) гораздо более высокая эффективность инкапсуляции может
сопровождаться частичной потерей активности чувствительных
макромолекул [143, 1285], в то время как небольшие лекарственные
препараты обычно не затрагиваются. Наконец, кристаллы, загруженные
посредством адсорбции, обычно склонны к более быстрому высвобождению
лекарственного средства, чем кристаллы, загруженные при совместном
синтезе [95, 977].
1.6. Б иферментные наночастицы на основе полиионных матриц
В настоящее время широко изучены возможности применения
различных биомедицинских приложений на основе нанозимов [144, 92], в
лечение противомикробных заболеваний [145, 3094] и лечение болезней
таких как заболеваний рака, костномозговой терапии и заживление ран [146,
278]. В настоящее время более нанозимы известны и зарегистрированы из
350 лабораторий в 30 стран мира [147, 1543; 148, 687]. Среди них нанозимы
углеродных соединений [149, 1275], наночастицы оксида железа [150, 3207;
151, 105], нанозимы на основе ферментов [83, 12182; 152, 211] и
наночастицы золота [153, 4200] широко изучаются и применяются.
Одним из подходов, направленных на увеличение стабильности
антиоксидантных ферментов, в том числе СОД1 и каталазы, является
включение их в наноразмерные полиионные комплексы [83, 12182; 154,
6644]. Создание фермент-полиэлектролитных комплексов (нанозимов) – одна
из наиболее простых методик получения таких формуляций. В ее основе
лежит самоорганизация комплексов между противоположно заряженными
амфифильными полимерами и ферментами . Изменение состава полимерного
39](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_39.png?v=1)
![ядра и морфологии подобных образований позволяет добиваться большей
биодоступности и направленной доставки лекарственного средства при
терапии различных заболеваний. Их стабилизация достигается ковалентным
сшиваниием комплексов в конъюгаты.
Способ получения биферментных комплексов, содержащие каталазу и
супероксиддисмутазу был показан [155, 227; 156, 303] с использованием
полиэлектролитов блок-сополимерами полиэтиленимина с
полиэтиленгликолем (ПЭИ-ПЭГ) и полиэтиленгликоля с полиглутаминовой
кислотой, с образованием комплексов в водном растворе последующей их
ковалентной сшивкой. В других работах по созданию нанозимов на основе
СОД1 и каталазы также приведены возможность использования различных
других поликатионов. Биферментные наночастицы, содержащие СОД1 и
каталазу, были также получены путем комлексообразования с положительно
заряженным блок-иономером полиэтиленимин-полиэтиленгликолем и [155,
227; 156, 303].
1.7. Методы определения кинетических характеристик ферментов
При исследовании механизма ферментативного катализа широко
применяются кинетические методы, основанные на изучение влияние
различных факторов (температуры, рН, концентрации фермента и субстрата
и т.д.) на скорость ферментативной реакции [157, 55; 158, 36 ; 159, 112].
Анализ литературных данных [160, 21; 161, 4; 162, 28; 163, 601; 164, 70; 165,
100, 166,1514; 167,75; 168,442] показал, что кинетический подход на основе
современных методов исследований является перспективным для изучения
ферментативной активности ферментов.
В большинстве случаев каталитическое действие ферментов связано с
образованием промежуточного комплекса фермент-субстрат, который далее
превращается в продукт реакции либо мономолекулярно, либо при участии
молекулы другого субстрата. В случае мономолекулярного превращения
комплекса фермент-субстрат схему процесса можно записать так:
40](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_40.png?v=1)
![S + E k
1
→
k
2← SE( 1.6 )
SE k3→
P+E(1.7 )
где S -субстрат, Е- фермент, Р- продукт реакции.
Скорость образования продукта реакции равна
ϑ= d[P]
dt = k3[SE ](1.8 )
Концентрация комплекса фермент-субстрат SE определяется
дифференциальным уравнением:
d [ SE ]
dt = k
1
[ S ][ E ] − k
2 [ S ][ E ] − k
3 [ S ][ E ] ( 1.9 )
Если обозначить общую концентрацию субстрата (в свободном
состоянии и в виде комплекса) S , а общую концентрацию фермента E , то
поскольку:
S=[SE ]+[S]
E =
[ SE ] + [ E ]
Уравнение (1.9) можно привести к виду:
d[SE ]
dt = k1SE −k1S[SE ]−k2[SE ]− k3[SE ]− k1¿
Практически концентрация фермента всегда много меньше, чем
субстрата и величиной E , а следовательно, и [ SE ] по сравнению с S можно
пренебречь, т.е. положить [ S ] = S . В этом случае:
d[SE ]
dt = k1SE −k1S[SE ]−k2[SE ]− k3[SE ]
Полагая концентрацию SE стационарной, можно найти долю фермента,
находящуюся в активной промежуточной форме:
[ SE ]
E = k
1 S
k
1 S + k
2 + k
3 = S
S + K
M ( 1.10 )
KM= k2+k3
k1
− константа Михаэлиса
Если k
3 << k
2 , то K = k
2 / k
1 и представляет собой константу диссоциации
комплекса фермент-субстрат. Однако такое неравенство выполняется не во
всех случаях. Подставляя (2.10) в (2.8) получим:
41](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_41.png?v=1)
![ϑ= d[P]
dt = k3SE
S+KM
(1.11 )Доля активной промежуточной формы фермента, а следовательно, и
скорость реакции растет с ростом концентрации субстрата и при больших
концентрациях последнего достигает предельного значения ϑ
max , равного:
ϑmax = k3E
При этих концентрациях субстрата весь фермент находится в активной
форме и уравнение (2.11) можно записать:
ϑ = ( ϑ
max ∙ S )
K
M + S − уравнение Михаэлиса
Величина
ϑmax может быть определена непосредственно, если удается
провести кинетические измерения при концентрации субстрата S >>
KM , т.к.
при этом
ϑ=ϑmax . Скорость реакции при этом не зависит от концентрации
субстрата до тех пор, пока S не упадет до значений, соизмеримых с К
м .
Реакция в этом диапазоне значений S нулевого порядка, т.е. идет с
постоянной скоростью. Константа Михаэлиса может быть определена как
концентрация субстрата, при которой скорость процесса равна. Величины
KM
, и ϑmax можно найти графически из зависимости ϑ от S . Для этого удобно
записать уравнение Михаэлиса в виде:
ϑ=ϑmax − KMϑ
S(1.12 )
1.7.1. Методы определения
KM и ϑmax
Константу Михаэлиса можно определить из графика Михаэлиса
(рис.2.8), найдя графическим способом максимальную скорость и
соответствующую величину концентрации субстрата, при которой скорость
ферментативной реакции будет вдвое меньше
ϑmax . Эта величина [ S ] и будет
KM
. Таким способом можно определить только приблизительную величину
константы Михаэлиса из-за трудности точного графического определения ϑ
max
.
42](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_42.png?v=1)
![Более удобными являются методы, в которых осуществлена
линеаризация уравнения Михаэлиса–Ментен, т.е. гиперболическая
зависимость ϑ от [ S ] переведена в линейную.
Для того чтобы построить такой график, необходимо определить в
одинаковых условиях при различных концентрациях субстрата и [ E ]= const
начальные скорости ферментативной реакции.
Рис. 1.8. Зависимость скорости ферментативной реакции от
концентрации субстрата
Метод Лайнуивера-Берка. Один из способов линеаризации уравнения
Михаэлиса-Ментен предложили Лайнуивер и Берк. Это так называемый
метод двойных обратных величин. Для линеаризации необходимо взять
обратные величины от левой и правой частей уравнения (2.12), в результате
чего оно преобразуется в уравнение вида,
1
ϑ0
= KM+[S]
ϑmax [S]
1
ϑ0
= KM
ϑmax [S]+ 1
ϑmax
согласно которому между величинами, обратными начальной скорости (
1
ϑ0 ,
ϑ−1
) и концентрации субстрата (1/[ S ], [ S ] -1
) соблюдается линейная
43](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_43.png?v=1)
![зависимо c ть, если механизм реакции подчиняется изложенным выше
представлениям (рис.2.9).
Рис.1.9. График зависимости 1/ V
0 от 1/[ S ] (график Лайнуивера-Берка)
Экспериментальная прямая пересекает ось абсцисс в точке (-1/[ S ] =
1/Км), а ось ординат – в точке (1/ ϑ
0 = 1/ ϑ
max ). Тангенс угла наклона равен KM
/ ϑ
max . Этим широко пользуются для определения параметров
KM
и ϑ
max , характеризующих связывающую и каталитическую функции
ферментов.
Метод Хайнса-Вульфа. В этом случае преобразуется уравнение
Лайнуивера-Берка путем умножения правой и левой частей на концентрацию
субстрата.
[S]
ϑ0
= KM
ϑmax
+ [S]
ϑmax
Графическая зависимость приведена на рис. 2.10.
Это прямая с наклоном 1/
ϑmax , отсекающая на осях [ S ]/ ϑ и [ S ] отрезки
KM
/ ϑmax и KM соответственно.
44](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_44.png?v=1)
![Рис.1.10. График зависимости [ S ]/ϑ от [ S ] (график Хайнса-Вульфа)
Метод Иди-Хофсти. При одном из таких графических преобразований
в так называемом графике Иди-Хофсти (pиc. 2.11) строят график зависимости
ϑ
от ϑ
/[ S ]. В этом случае точка пересечения прямой, полученной путем
наилучшей линейной аппроксимации экспериментальных точек, с осью
ординат соответствует ϑ
max , а тангенс угла наклона равен –
KM
. Данный способ линеаризации приведен на рис. 1.11.
Рис. 1.11. График зависимости ϑ
от ϑ
/[ S ] (график Эди-Хофсти)
45](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_45.png?v=1)
![Метод Эйзенталя и Корниш-Боудена. Много позднее Эйзенталь и
Корниш-Боуден предложили иной метод графического представления
результатов исследования кинетики ферментативных реакций – так
называемый прямой линейный график. Уравнение Михаэлиса-Ментен они
преобразовали в виде зависимости ϑmax от KM :
KM=ϑ+ ϑ
[S]ϑmax
Для любой пары значений [ S ] и
ϑ можно построить зависимость ϑmax от
KM
. Она представляет прямую с наклоном, равным ϑ /[ S ], и отрезками,
отсекаемыми на осях K
M и ϑ
max , соответственно равными -[ S ] ϑ
. Если провести
прямые для нескольких пар значений [ S ] и
ϑ , то эти прямые пересекутся в
одной точке, координаты которой дадут единственные значения ϑ
max от K
M ,
удовлетворяющие всем парам значений [ S ] и
ϑ .
Уравнение Михаэлиса лежит в основе всех кинетических исследований
ферментативных реакций, так как оно позволяет рассчитать количественные
характеристики ферментов и проводить анализ их ингибирования. Величины
KM
и ϑ
max являются важнейшими характеристиками ферментов и их можно
определить, используя линеаризованные формы уравнения Михаэлиса-
Ментен. Таким образом, графические методы для определения ϑ
и K
M могут
быть применены, но в настоящее время данные ферментативной кинетики
обрабатываются быстрее и более объективно с помощью компьютерных
программ.
46](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_46.png?v=1)
![ набор для определения концентрации белка Micro BCA™ Protein
Assay Kit на основе бицинхониновой кислоты (Thеrmо Fishеr Sciеntific,
США).
для определения активности СОД1:
пирогаллол (С
6 Н
6 О
3 ), ацетон (СН
3 СОСН
3 ),
трис(гидроксиметил)аминометан (ТРИС, ( HOCH
2 )
3 CNH
2 )) (Sigma-Aldrich,
США).
для определения активности каталазы:
Н
2 О
2 (0,196 М); 0,1 М фосфатного буфера, рН = 7,0.
2.2. Методы исследования
2.2.1. C интез микросфер ватерита CC
Синтез CC проводили согласно известной методики [169, 3; 170, 3398;
171, 52; 172, 95; 173, 438; 174, 4230; 175, 8822]. Для этого 1 мл 1 M CaCl
2
смешивали с 3 мл воды и быстро добавляли 1 мл 1 М Na
2 CO
3 . Полученную
смесь тщательно перемешивали на магнитной мешалке (180-200 об/мин) в
течение 40 с при 20°С. После этого реакционную смесь инкубировали без
перемешивания 15-20 мин. Образовавшегося осадок промывали 3-х кратно 5
мл воды и сушили при 70°С в течение 2 ч.
2.2.2. Синтез С at - CLEAs
Получение микросфер ватерита c каталазой CC-Cat
Для получения CC-Cat 1 мл 1 М раствора CaCl
2 смешивали с 3 мл
раствора каталазы (4 мг/мл) в ТРИС буфере (0,05 М, рН 7,0) и перемешивали
в течение 15 мин. Затем быстро добавляли 1 мл 1 М раствора Na
2 CO
3. Смесь
перемешивали на магнитной мешалке (180-200 об./мин) в течение 40 с при
20° C и инкубировали без перемешивания в течение 15-20 мин. Осадок
микросфер промывали 3-х кратно 5 мл воды и при необходимости сушили
при 70° C в течение 2 ч.
Сшивание CC-Cat глутаровым альдегидом для получение CC - Cat - GA
51](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_51.png?v=1)
![Для сшивания глутаровым альдегидом CC-Cat получали по описанной
выше методике, заменяя в третьей промывке воду на ТРИС буфер (0,05 М, рН
8,0). Далее к осадку добавляли необходимое количество 0,03 М водного
раствора глутарового альдегида (до достижения мольного соотношения
G А/каталаза от 0/1 до 900/1) и инкубировали в течение 12-14 ч (4°С) при
постоянном перемешивании. После этого осадок однократно промывали
водой.
Растворение карбонатной матрицы
Растворение CC-Cat и CC - Cat - GA проводили водным раствором тремя
способами:
1) однократным добавлением к осадку 0,2 М раствора ЭДТА,
эквимолярного количества образовавшегося в ходе синтеза ватерита (4 мл);
2) добавлением к осадку по 100 мкл 0,2 М раствора ЭДТА с
интервалом 1-1,5 мин при легком перемешивании смеси до полного
растворения карбоната кальция;
3) добавлением к осадку по 100 мкл 0,1 М раствора ЭДТА с
интервалом 1-1,5 мин при легком перемешивании смеси до полного
растворения карбоната кальция.
Образцы хранили при 4°С. При необходимости удаление из
реакционной среды солей проводили диализом или центрифугированием и
промывкой осадка Cat - CLEAs .
2.2.3. Синтез mCat - CLEAs
Получение МНЧ оксида железа методом термического разложения
ацетилацетоната железа (III) в бензиловом спирте. Синтез МНЧ
проводили по методике, описанной в [176, 3024]. Для этого в трёхгорлую
тщательно высушенную колбу объемом 250 мл с обратным водяным
холодильником, термометром и газовым инжектором помещали 2,14 г
Fe(acac)3 и 45 мл бензилового спирта. Реакционную смесь продували
аргоном, медленно нагревали до температуры 100°С и при постоянном
52](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_52.png?v=1)
![Анализ концентрации каталазы. Концентрацию каталазы определяли
спектрофотометрическим методом при длине волны 280 нм, с
использованием градуировочного графика (рис. 2.2).
Рис. 2.2. Градуировочный график определения концентрации каталазы
спектрофотометрическим методом
Определение активности каталазы . Активность исходной каталазы и
всех содержащих каталазу образцов определяли на спектрофотометре
“ SpectraMax M 5” ( Molecular Devices , США) согласно [177, 133].
Анализируемый образцы разбавляли до концентрации белка 0,005 - 0,010
мг/мл. В кювете смешивали 820-870 мкл 0,1 M фосфатного буфера (рН 7,0),
30 – 80 мкл разбавленного раствора каталазы, 100 мкл 0,196 М Н
2 О
2 до
достижения общего объема реакционной смеси 1000 мкл. Измеряли
показания оптической плотности при длине волны 240 нм в течение 30 с.
Падение оптической плотности за 30 с составляло 0,03-0,07 о.е./мин (рис.2.3).
57](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_57.png?v=1)
![Рис. 2.3. Примерный вид графика при определении ферментативной
активности каталазы
Активность (А, ед./мл) и удельную активность каталазы (А
уд. , ед./мг)
рассчитывали по следующим формулам:
A = ∆ D
240 ∙ 1000 ∙ P
0,0436 ∙ V
ал ( 2.1 )
A
уд = A / С
кат ( 2.2 )
где
Δ D
240 – изменение поглощения субстрата в мин, о.е./мин;
С
кат – весовая концентрация белка, мг/мл;
V
ал – объём аликвоты раствора каталазы в кювете, мкл;
0,0436 – изменение поглощения, соответствующее разложению 1
мкмоль Н
2 О
2 в мин;
Р – разведение анализируемого раствора каталазы.
Определение активности СОД1. Анализ активности нативной СОД1 и
фермента в составе всех СОД1 содержащих образцов проводили с
использованием метода, в основе которого лежит реакция ингибирования
автоокисления пирогаллола [41, 650; 178, 548] . Согласно данной методике,
измерения проводили в 96-луночном планшете. Для одного образца
использовали 8 лунок (один столбец). Последовательным разведением
58](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_58.png?v=1)
![Определение содержания железа на МНЧ. Определение содержания
железа проводили с помощью фотометрического титрования, основанного на
образовании ионами Fe 3+
окрашенного комплекса с феррозином [179,
779]. Для этого в пробирку объемом 1,5 мл добавляли 20 мкл образца и
80 мкл царской водки (смесь концентрированных азотной и соляной кислот в
объёмном соотношении 1:3). Смесь перемешивали на шейкере ( Biosan TC -
100 C ) при температуре 80 о
С в течение 1 часа. Затем растворы перенесли в
фалькон объёмом 15 мл и содержимый раствор доводили до 10 мл водой. Из
пробирок отбирали 400 мкл образца, добавляли 200 мкл воды и 40 мкл
реагента.
В качестве стандартных образцов использовали раствор стандарта Fe 3+
с
концентрациями 10, 20, 50, 100, 200, 250, 500, 1000 мкг/мл. Полученную
смесь раскапывали в лунки полистирольного микропланшета в 2-х повторах
и определяли поглощение при длине волны λ = 560 нм. Концентрацию Fe 3+
в
неизвестных образцах определяли по калибровочной кривой стандартных
образцов (рис. 3.5).
Ри c . 2.5. Зависимость поглощения D
560 от концентрации
стандартных образцов Fe 3+
Реагент для теста готовили по следующей схеме: в пробирке объемом
15 мл смешивали 32 мг феррозина , 3,85 г ацетата аммония и 3,5 г
60](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_60.png?v=1)
![ГЛАВА III . ПОЛУЧЕНИЕ И ИССЛЕДОВАНИЕ МИКРОСФЕРЫ С LEA s
В ВАТЕРИТНОЙ МАТРИЦЕ
3.1. Разработка метода получения Cat - CLEAs
Для получения микросфер ватерита с каталазой использовали метод
соосаждения. Применение данного метода позволяет загружать биологически
активные вещества различной природы на стадии получения микросфер
ватерита [170, 3398; 171, 53; 180, 1500386; 181, 918]. Биологически активные
вещества добавляют к растворам солей (например, CaCl
2 и Na
2 CO
3 ) перед их
смешиванием. Известно [170, 3399; 172, 95; 174, 4230; 175, 8823], что при
соосаждении концентрация биологически активных веществ в микросферах
ватерита в десятки раз превышает концентрацию биологически активных
веществ при физической адсорбции. Включение малых незаряженных
молекул проблематично из-за их свободной диффузии из частиц ватерита
сквозь поры. Включение малых молекул становится возможным, если они
заряжены противоположно сферам ватерита. Принимая во внимание, что
коллоидная частица каталазы имеет противоположный заряд микросферам
ватерита преспективным является применение метода соосаждения
микросфер ватерита с каталазой [171, 52; 172, 97; 174, 4230].
Получение Cat - CLEAs проводили согласно схеме, приведенной на
рис.5. Микросферы ватерита с соосажденной каталазой (продукт CC-Cat)
были получены сливанием растворов солей CaCl
2 и Na
2 CO
3 в присутствии
фермента. После промывки образовавшихся частиц от не связавшейся
каталазы была проведена обработка глутаровым альдегидом (200/1 моль
G А/моль белка согласно [141, 1213] ) с последующей отмывкой от избытка
непрореагировавшего бифункционального агента (продукт CC - Cat - GA ) и
растворением карбонатной матрицы раствором ЭДТА (продукты Cat - GA или
Cat -С LEAs ).
62](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_62.png?v=1)
![Изучение кинетики разложения Н
2 О
2 в присутствии катализатора –
каталазы проводили при комнатной температуре. Исходя из концентрации
разлагаемого перекиси водорода находили содержания О
2 .
Полученные результаты представлены в таблице 3.3.
Таблица 3.3.
Исходн ые данные для определения кинетики разложения перекиси
водорода
[S] V 1/[S] 1/[ V ]
1 0,1 0,005 10 200
2 0,2 0,012 5 83,33333
3 0,3 0,02 3,333333 50
4 0,4 0,033 2,5 30,30303
5 0,5 0,041 2 24,39024
6 0,6 0,05 1,666667 20
7 0,7 0,056 1,428571 17,85714
8 0,8 0,059 1,25 16,94915
9 0,9 0,06 1,111111 16,66667
10 1 0,062 1 16,12903
11 1,1 0,063 0,909091 15,87302
12 1,2 0,064 0,833333 15,625
13 1,3 0,065 0,769231 15,38462
14 1,4 0,066 0,714286 15,15152
15 1,5 0,067 0,666667 14,92537
16 1,6 0,067 0,625 14,92537
На основе полученных данных построили график зависимости скорости
разложения перекиси водорода от концентрации субстрата (рис. 3.15).
76](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_76.png?v=1)
![Рис. 3.15. Зависимость скорости разложения Н
2 О
2 от концентрации
субстрата
Как видно из рис. 3.15 скорость разложения перекиси водорода от
концентрации кислорода имеет логарифмическую зависимость с
квадратическим значением коэффициента корреляции 0,963. Данный факт
подтверждает закономерного протекания изучаемой реакции.
Для определения значения константу уравнения Михаэлса-Ментен
построили график зависимость 1/ϑ от 1/ [ S ]
(рис. 3.16). Данная зависимость
имеет строго линейный характер со значениями
KM
ϑmax
=19,711 и 1
ϑmax
=5,818 5,818
квадратическим значением коэффициента корреляции 0,973.
Из полученных данных можно рассчитать значения
KM и ϑmax :
K
M = 19,711
5,818 = 3,338 ;
ϑ
max = 1
5,818 = 0,1719 моль
л ∙ с
С учетом число разведения значение
ϑmax составляет ϑ
max = 1719 моль
л ∙ с .
77](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_77.png?v=1)
![Рис. 3.16. Зависимость 1/ ϑ
от 1/[S]
Для получения значений скорости исследуемой ферментативной
реакции использовалось уравнение Михаэлиса-Минтен:
ϑ=ϑmax
[S]
K M+[S]
Величины
KM и ϑmax были найдены графическим способом из
зависимости 1/ ϑ
от 1/
[S].
Полученные результаты согласуются с имеющимся литературными
данными.
На основании проведенных исследований обоснованы оптимальные
условия получения микросфер каталазы на основе ватеритной матрицы. В
качестве хелатирующего агента для растворения ватеритной матрицы
рекомендовано использование 0,1 М ЭДТА путём дробного добавления
агента при соотношении сшивающего агента ГА/каталазе 200/1. Определены
основные физико-химические параметры – размер и морфология частиц,
78](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_78.png?v=1)
![электрокинетический потенциал частиц, величины констант уравнения
Михаэл и са-Минтена и т.п.
3.2. Разработка метода получения mCat - CLEAs
3.2.1. Получение и свойства mCat - CLEAs
На сегодняшний день одним из развивающимся подходов в области
получения микросфер ферментативных наночастиц является использование
низкочастотного переменного поля в присутствии МНЧ. Технология
получения магниточувствительных CLEAs и возможность управления такими
частицами под влиянием НЧ ПМП позволяет поднять на новый уровень
сложности и актуальности CLEAs путем проведения поперечной сшивки при
наличие магнитных наночастиц.
Известно, что [ 182, 296; 183, 2064; 184, 12; 185, 7238; 186, 145; 187,
110] для получения mCat - CLEAs используют магнитные наночастицы. Для
решения поставленной задачи нами использовано в качестве МНЧ оксид
железо, позволяющие повысить стабильность синтезированных наночастиц
оксида железа путем их покрытие дофамином.
Для получения mCat - CLEAs использовали наночастицы оксида железа,
полученные термическим разложением ацетилацетона железа ( III ) в
бензиловом спирте и покрытые дофамином [176, 3025; 182, 296]. На рис. 4.15
приведена микрофотография МНЧ с применением ПЭМ. Установлено, что
магнитные наночастицы имели в зависимости от условий проведения синтеза
гидродинамический диаметр в интервале от 5-10 нм.
В эксперименте применены синтезированные МНЧ сферической
формы размером 9±2 нм с одновременным добавлением с ферментом
каталазы в систему при получении микросфер ватерита. Установлено, что
одновременное введение в ватерит магнитных наночастиц и каталазу не
привело к изменению формы mCat - CLEAs , как и в других случаях синтеза
С LEAs .
79](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_79.png?v=1)
![Рис. 3.16. Микрофотография ПЭМ магнитных наночастиц [182, 30]
Схема получения синтеза приведена на рис. 3.17.
Рис. 3.17. Схема получения mCat - CLEAs
Одновременное введение в ватерит магнитных наночастиц и каталазу
не привело к изменению формы mCat - CLEAs , что и наблюдалось при синтезе
Са t - CLEAs (рис. 3.18).
Рис. 3.18. ПЭМ снимок mCat - CLEAs
80](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_80.png?v=1)
![с ПЭИ-ПЭГ [155, 227], ни при получении двухслойных (поликатион-
полианион) комплексов СОД1 [188, 226].
Таблица 4.2
Гидродинамические размеры комплексов и конъюгатов
СОД1/каталаза (10 мМ HEPES , рН=6,8)
Мольное соотношение
СОД1/каталаза До сшивания с G А После сшивание с G А
d , nm PDI d , nm PDI
2:1 136 ± 5 0,026 254 0,196
3:1 144 ± 5 0,070 296 0,252
4:1 145 ± 4 0,130 316 0,276
Влияние природы и концентрации буферного раствора на размеры
комплексов и комнъюгатов СОД1/каталаза на основе протамина и ПЭГ-ПГ
иллюстрирует рис. 4.1.
н
Рис. 4.1. Зависимость гидродинамических размеров комплексов и
конъюгатов СОД1/каталаза на основе двухслойной полимерной
матрицы (протамина и ПЭГ-ПГ) от природы и концентрации буфера
(рН=7,4, СОД1/каталаза 2:1)
Во-первых, при уменьшении концентрации буферных растворов
наблюдается уменьшение размеров частиц. Это можно объяснить тем, что с
уменьшением концентрации ионов в растворе происходит сужение двойного
90](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_90.png?v=1)
![43. Buschfort C. et al. DNA excision repair profiles of normal and leukemic
human lymphocytes: functional analysis at the single-cell level //Cancer
research. – 1997. – V. 57. – №. 4. – P. 651-658.
44. Scibior D., Czeczot H. Katalaza–budowa, właściwości, funkcje [Catalase:
structure, properties, functions] //Postepy Hig Med Dosw (Online). – 2006. –
V. 60. – P. 170-180.
45. Шинкаренко Н. В., Алесковский В. Б. Химические свойства синглетного
молекулярного кислорода и значение его в биологических системах
//Успехи химии. – 1982. – Т. 51. – №. 5. – С. 713-735.
46. Хавинсон В. Х. и др. Свободнорадикальное окисление и старение. –
2003. C . 327.
47. Cao L. Carrier-bound immobilized enzymes: principles, application and
design. – John Wiley & Sons, 2006. P. 169-293.
48. Brady D., Jordaan J. Advances in enzyme immobilisation //Biotechnology
letters. – 2009. – V. 31. – №. 11. – P. 1639-1650.
49. Sheldon R. A. Cross-linked enzyme aggregates as industrial biocatalysts
//Organic Process Research & Development. – 2011. – V. 15. – №. 1. – P .
213-223.
50. Talekar S. et al. Parameters in preparation and characterization of cross linked
enzyme aggregates (CLEAs) //Rsc Advances. – 2013. – V. 3. – №. 31. – P.
12485-12511.
51. Cao L., van Langen L., Sheldon R. A. Immobilised enzymes: carrier-bound or
carrier-free? //Current opinion in Biotechnology. – 2003. – V. 14. – №. 4. – P.
387-394.
52. Sheldon R. A. Enzyme immobilization: the quest for optimum
performance //Advanced Synthesis & Catalysis. – 2007. – V. 349. – №. 8 9. –‐
P. 1289-1307.
53. Illanes A., Wilson L., Aguirre C. Synthesis of cephalexin in aqueous medium
with carrier-bound and carrier-free penicillin acylase biocatalysts //Applied
biochemistry and biotechnology. – 2009. – V. 157. – №. 1. – P. 98-110.
103](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_103.png?v=1)
![154. Mitragotri S. et al. Accelerating the translation of nanomaterials in
biomedicine //ACS nano. – 2015. – V. 9. – №. 7. – P. 6644-6654.
155. Угланова С. В. и др. Стабилизация ферментов-антиоксидантов в
комплексах и конъюгатах с блоксополимерами: перспективы лечения
заболеваний центральной нервной системы //Вестник Московского
университета. Серия 2. Химия. – 2010. – Т. 51. – №. 3. – С. 227-234.
156. Тагирова М. А. и др. Получение двухслойного полиионного
биферментного комплекса супероксиддисмутазы 1 и каталазы
минимального размера //Вестник Московского Университета. – 2020. –
Т. 61. – №. 4. – С. 303-308.
157. Алиев С. А., Гаджиев Д. А., Микайылов Ф. Д. Кинетические и
термодинамические характеристики ферментов инвертазы и уреазы в
почвах Азербайджанской ССР //Почвоведение. – 1984. – №. 11. – С. 55-
66.
158. Климова Е. В. Активность каталазы и дегидрогеназы в почвах,
загрязненных нефтью и нефтепродуктами //Экологическая безопасность
в АПК. Реферативный журнал. – 2004. – №. 1. – С. 36-36.
159. Асеева И. В., Паников Н. С. Кинетика ферментативных процессов
распада нуклеиновых кислот в почве //B кн.: Экологические условия и
ферментативная активность почв. Уфа. – 1979. – С. 112-124.
160. Кирюшина К. А. Использование этилового спирта для очистки каталазы
из печени крупного рогатово скота и изучение некоторых кинетических
параметров фермента //Химия-XXI век. Теория, практика, образование. –
2020. – С. 21-23.
161. Зимин Ю. В., Соловьева А. Г., Уланова А. А. Оценка кинетических
параметров ферментов в гетерогенной надмолекулярной системе
//Фундаментальные исследования. – 2013. – Т. 1. – №. 2.
162. Keleti T. Osnovy fermentativnoy kinetiki [Fundamentals of enzyme
kinetics] //Moscow: Mir Publ. – 1990.
114](https://docx.uz/documents/141347c8-daa0-467a-bf72-93ca1c3d8db6/page_114.png?v=1)
Иммобилизация антиоксидантных ферментов